ICS 11.020 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5105—2019 国境口岸轮状病毒（B组实时荧光 RT-PCR检测方法 Detection method of Rotavirus( group B) by real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5105—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口 深圳市计量质量检测研究院。 本标准主要起草人：莫秋华、杨坤宇、杨泽、汪海波、史蕾、陈晶、陈新彬、吴锦顺、涂承宁、史咏梅、 杨国武。 业标准信息服务平台 SN/T5105—2019 国境口岸轮状病毒（B组）实时荧光 RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸成人腹泻轮状病毒（B组）实时荧光RT-PCR检测的对象、检测方法及结果 报告。 本标准适用于国境口岸成人腹泻轮状病毒（B组）的实验室检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1720出入境口岸轮状病毒感染监测规程 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3术语和定义 3.1 轮状病毒 rotavirus 属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotauirus），为双链RNA病毒，基因组分11个节段， 是引起人类、哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒有7个血清组（A～G），其中A、B、C组能 引起人和动物腹泻。A组轮状病毒最常见，它是婴幼儿腹泻首要的致病原。B组轮状病毒感染对象没 有年龄限制，主要感染15一45岁的青壮年，但也可感染老人和婴幼儿，故又定名为成人腹泻轮状病毒 (adult diarrhea rotavirus,ADRV). 3.2 逆转录聚合酶链反应reverse transcription polymerase chain reaction;RT-PCR 将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法逆 转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物， 在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”：随 后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最 终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 3.3 实时荧光RT-PCRreal-timefluorescenceRT-PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后PCR扩增的产物进行标记跟踪，利用荧 光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。 1 SN/T 5105—2019 本标准所采用的荧光探针是分子信标（molecularbeacon）探针。分子信标探针是一种荧光标记的寡核 苷酸链，一般含有25～35个核苷酸。在结构上，分子信标探针可以分为三部分，即环状区、茎干区、荧光 两端的核酸序列互补配对形成的5～8个碱基对的DNA双链结构，在分子信标与靶分子结合过程中可 发生可逆性解离；荧光基团和萍灭基团：荧光报告基团（如FAM）一般连接在5端，荧光率灭基团（如 Dabcyl)一般连接在3端。自由状态时的分子信标呈发夹结构，此时由于荧光基团与淬灭基团靠得很 近，荧光被淬灭；当与靶序列结合后，分子信标的空间构型发生改变，使荧光基团与灭基团距离变大， 分别位于伸展开的探针的两端，荧光得以恢复。分子信标技术具有很高的特异性，而且操作简便、灵敏 度高，特别是它可以进行实时定量检测，甚至可以用于活体分析。 3.4 Ct值Cyclethreshold 在荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate) 本为准 PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis） HPLC:高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography） bp：碱基对（basepair） DABCYL:4,4-二甲氨基-偶氮苯-4'-羧酸（4,4-dimethylamino-azobenzene-4'-carboxylic acid) 5检测对象 准信息服 5.1国境口岸发现的有呕吐、腹泻和发热等症状疑似腹泻病毒感染的急性肠胃炎病人。 5.2其他申请检验的人员。 6 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的规定。PCR防污染措施按 WS/T230的规定执行。 7主要仪器 主要仪器设备如下： 一二级B型生物安全柜： 台式高速冷冻离心机（最高离心力12000×g以上）； 一旋涡振荡器； 一冰箱：4℃、一20℃和-70℃； ——超净工作台； 2