ICS 11.020 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5100—2019 国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时 荧光RT-PCR检测方法 Detection method for Kyasanur Forest disease virus by real-time fluorescence RT-PCR at frontier ports 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5100—2019 前言 本标准根据GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、新疆国际旅行卫生保健 中心。 本标准主要起草人：马雪征、张丽萍、杨烨、胡孔新、孙肖红。 业标准信息服务平台 SN/T5100—2019 国境口岸卡萨诺尔森林病病毒实时 荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸卡萨诺尔森林病病毒检测的生物安全要求、标本的采集、运输和保存、标本 的处理，卡萨诺尔森林病病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于国境口岸人出境人员携带卡萨诺尔森林病病毒的核酸检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用 病原微生物实验室生物安全通用准则 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（原中华人民共和国卫生部令 第45号） 人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部） 人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部） 业标准信 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 卡萨诺尔森林病病毒（KyasanurForestdiseasevirus，KFDV） 该病毒属于黄病毒科的哺乳动物蜱传病毒组，于1957年被发现，源自印度纳塔克邦卡萨诺尔森林 病死的猴子身上。自那时起，每年有400～500人类病例被报道。该病的症状包括高热与额叶头痛，伴 有出血症状，如鼻腔出血、咽喉出血和牙龈出血，以及胃肠出血等。蜱为主要传播媒介，可引起发热、出 血、肌痛和脑炎，死亡率为3%～5%，主要分布在印度西部地区，我国研究人员从1989年采集的一名发 热患者血清标本中分离到Nanjianyinvirus后经分子生物学等方法鉴定为KFDV的变异株，提示在我 国云南横断山脉地区曾有KFD的发生。 3.2 实时荧光RT-PCRreal-timefluorescenceRT-PCR 实时荧光RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的实时荧光探针。该探针为 一段募核酸，两端分别标记一个报告基团和一个率火实时荧光基团。探针完整时，报告基团发射的实 时荧光信号被萍灭基团吸收；PCR扩增时，利用Taq酶的5-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告实 时荧光基团和率火基团分离，从而实时荧光监测系统可以接受到实时荧光信号。每个反应管内的实时 荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ct值表示。 1 SN/T 5100—2019 3.3 Ct 值 Ct值是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate) FAM:6-羧基一荧光素（6-carboxy-fluorescein） BHQl：黑洞淬灭基团（blackholequencher1） 5检测对象 出人境口岸发现的可疑病例。 6 实验室生物安全和PCR防污染要求 为准 按照GB19489、《人间传染的病原微生物名录》和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或 样本运输管理规定》的要求，相关材料的生物安全要求如下：区 卡萨诺尔森林病病毒危害程度分类为第一类； 实验室应遵循GB19489和WS233，未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（BSL-3 或ABSL-3）实验室内进行，灭活材料在生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室内进行； 卡萨诺尔森林病病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814； 使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理： 疑似卡萨诺尔森林病病毒材料的包装及转运应符合原中华人民共和国卫生部第45号令； PCR防污染措施按照WS/T230的规定执行。 标准信息服务平台 7仪器 本方法使用的主要仪器如下： 实时荧光PCR仪； 超净工作台； 二级生物安全柜； 高压灭菌锅； 低温高速离心机：最大离心力20000s： 漩涡振荡器； 冰箱：4℃、20℃和-70℃； 移液器：10μL20μL、100μL、200μL和1mL; 恒温水浴锅； 无菌注射器。 8试剂 本方法使用的主要试剂如下： 2