ICS 71.100.70 Y 42 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1338—2013 化妆品中天然红 4 含量测试方法 Determination of natural red 4 in cosmetics 2013-08-01 发布 福建省质量技术监督局 2013-11-01 实施 发 布 DB35/T 1338—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则编写。 本标准由福建省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：福建省产品质量检验研究院。 本标准主要起草人：林钦、游飞明、戴明、郑小严、谢勇。 I DB35/T 1338—2013 化妆品中天然红 4 含量测定方法 1 范围 本标准规定了高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法测试化妆品中天然红4含量的方法。 本方法适用于化妆品中天然红4含量的测定。 本方法液相色谱法天然红4（以胭脂虫红酸计）的检出限为0.2 mg/kg；液相色谱-串联质谱法天然 红4（以胭脂虫红酸计）的检出限为0.1 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-2008，neq ISO 3696：1987） 3 高效液相色谱法 3.1 方法原理 试样采用盐酸溶液在沸水浴下提取，用聚酰胺固相萃取小柱富集、净化，氨水/甲醇溶液洗脱后注 入高效液相色谱仪—紫外检测器进行测定，外标法定量。 3.2 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。 3.2.1 甲醇：色谱纯。 3.2.2 乙腈：色谱纯。 3.2.3 甲酸：优级纯。 3.2.4 氨水：优级纯。 3.2.5 盐酸：36%-38%。 3.2.6 洗脱液配制：250 ml 甲醇+250 ml 水+5.0 ml 氨水。 3.2.7 稀释液配制：250 ml 甲醇+250 ml 水+5.0 ml 甲酸。 3.2.8 聚酰胺固相萃取小柱制作： 取 3 ml 的固相萃取用空柱， 下端放一筛板，将粒度为 74 μm～ 150μm（100 目～200 目）的聚酰胺粉加入甲醇成浆状，湿法装填，上筛板用玻璃棒压实，聚酰胺填料 的厚度约为 2 cm。使用前用 2 ml 酸化甲醇（500 ml 甲醇+10 ml 甲酸）和 2 ml 水淋洗活化。 3.2.9 胭脂虫红酸（CAS 1260-17-9，C22H20O13，纯度 98.5%）。 1 DB35/T 1338—2013 3.2.10 胭脂虫红酸标准溶液 准确称取20.0 mg胭脂虫红酸标准品，加水溶解定容到100 ml，准确移取适量混合标准储备液，用 稀释液稀释成0.4 μg/ml、0.8 μg/ml、1.0 μg/ml、2.0 μg/ml、5.0 μg/ml系列标准溶液。 3.3 仪器和设备 仪器和设备如下： a) 高效液相色谱仪：配紫外检测器； b) 涡旋混合器； c) 冷冻高速离心机：15000 r/min； d) 固相萃取装置； e) 超声波振荡器； f) 分析天平：感量 0.0001 g； g) 移液枪：100 μl～1000 μl； h) 一次性过滤头：聚四氟乙烯（PTFE），0.2 μm。 3.4 分析步骤 3.4.1 试样的制备与提取净化 称取均匀试样约2.5 g（精确到0.0001 g）于50 ml离心管中，加入2 mol/l HCl 10.0 ml，旋紧盖 子，置于沸水浴中提取30 min。取出冷却至室温后加入15.0 ml甲醇，振摇混匀，置于离心机中，15000 r/min离心5 min。取5.0 ml上清液于10 ml试管中，加入5 ml水混匀。将溶液移入聚酰胺小柱，控制流 速1 ml/min～2 ml/min，用5 ml水淋洗小柱，抽干。用2.0 ml洗脱液洗脱并用5 ml刻度试管收集，加入 300 μl甲酸并用水定容到2.5 ml，混匀，用一次性过滤头（3.3.8）过滤后，供测定。 3.4.2 高效液相色谱操作条件 高效液相色谱操作条件如下： a) 色谱柱：C18 柱，150 mm× 4.6 mm（内径），粒径 5 μm，或相当者； b) 柱温：35 ℃； c) 紫外检测波长：276 nm； d) 进样量：20 μl； e) 流动相及梯度条件见表 1: 表1 流动相及梯度表 时间 流速 0.3%甲酸 乙腈 min ml/min % % 0 1.0 80 20 2.0 1.0 80 20 2.1 1.0 30 70 3.0 1.0 30 70 3.1 1.0 80 20 8.0 1.0 80 20 注：上述高效液相色谱操作条件为参考条件，可根据不同仪器、色谱柱进行适当调整。 2 DB35/T 1338—2013 3.4.3 定量测定 外标法定量：以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标 准工作曲线对试样中待测组分进行定量，试样溶液的响应值应在标准工作曲线线性范围内。在上述色谱 条件下，标准品色谱图见附录 A 中图 A.1。 3.5 结果计算 试样中天然红4（以胭脂虫红酸计）的含量按式（1）计算，结果保留到小数点后两位： = X c ×V × k ...................................... (1) m 式中： X——试样中天然红4（以胭脂虫红酸计）的含量，单位为（mg/kg）； m——试样的质量，单位为（g）； c——试样溶液中胭脂虫红酸的浓度，单位为（μg/ml）； V——提取液体积，单位为（ml）； k——稀释因子。 3.6 允许差 在相同操作条件下，两次平行测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的15 %。 4 液相色谱-串联质谱法 4.1 原理 试样采用盐酸溶液在沸水浴下提取，用聚酰胺固相萃取小柱富集、净化，氨水/甲醇溶液洗脱后注 入超高效液相色谱-串联四级杆质谱仪进行测定，外标法定量。 4.2 试剂和材料 按本标准3.2进行 4.3 仪器和设备 仪器和设备如下： a) 超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪：配有电喷雾（ESI）离子源； b) 涡旋混合器； c) 超声波振荡器； d) 固相萃取装置； e) 冷冻高速离心机:15000 r/min； f) 分析天平:感量 0.0001 g； g) 移液枪：100 μl～1000 μl； h) 一次性过滤头：聚四氟乙烯（PTFE），0.2 μm。 4.4 分析步骤 3 DB35/T 1338—2013 4.4.1 试样的制备与提取净化 按本标准3.4.1进行 4.4.2 高效液相色谱条件 高效液相色谱条件如下： a) 色谱柱：C18 柱，100 mm×2.1 mm（内径），粒径 1.7 μm，或相当者； b) 柱温：35 ℃； c) 进样量：10 μl； d) 流动相及梯度条件见表 2： 表2 流动相及梯度表 时间 流速 0.3%甲酸 乙腈 min ml/min % % 0 0.3 80 20 1.5 0.3 80 20 1.6 0.3 40 60 2.0 0.3 40 60 2.1 0.3 80 20 4.0 0.3 80 20 4.4.3 质谱分析条件 质谱分析条件如下： a) 电离源：电喷雾正离子模式； b) 毛细管电压：4.00 KV； c) 源温度：120 ℃； d) 脱溶剂气温度：400 ℃； e) 脱溶剂气流量：700 l/h； -3 f) 碰撞室压力：3.110 mbar g) 特征离子及其它质谱参数见表 3： 表3 特征离子及其它质谱参数 + 化合物 母离子（M+H） 天然红 4 m/z 493.0 子离子 锥孔电压 碰撞能量 m/z V eV 354.8* 20 25 373.0 20 15 注1：*定量离子 注2：上述质谱分析条件为参考条件，可根据不同仪器、色谱柱进行调整。 4.4.4 定性测定 每种被测组分选择1个母离子，2个子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准 4 DB35/T 1338—2013 溶液中对应的组分保留时间偏差应在 2.5 %之内；且样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近 的混合基质标准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表 4 规定的范围，则可 判定为样品中存在对应的待测物。 表4 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 % 最大允许偏差 % ＞50 ＞20 ＞10 ≤10 ±20 ±25 ±30 ±50 4.4.5 定量测定 外标法定量：以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标 准工作曲线对试样中待测组分进行定量，试样溶液的响应值应在标准工作曲线线性范围内。在上述色谱 条件下，标准品色谱图见附录 A 中图 A.2。 4.5 结果计算 试样中天然红4（以胭脂虫红酸计）含量按式（2）计算，结果保留到小数点后两位： = X c ×V × k ...................................... (2) m 式中： X——试样中天然红4（以胭脂虫红酸计）的含量，单位为（mg/kg）； m——试样的质量，单位为（g）； c——试样溶液中胭脂虫红酸的浓度，单位为（μg/ml）； V——提取液体积，单位为（ml）； k——稀释因子。 4.6 允许差 在相同操作条件下，两次平行测定结果的绝对差值不大于其算术平均值的15 %。 5 DB35/T 1338—2013 附 录 A （资料性附录） 胭脂虫红酸标准品的液相色谱图和液-质色谱图 AU 3.352 0.10 0.05 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 分钟 5.00 6.00 图A.1 胭脂虫红酸标准品的液相色谱图 图A.2 胭脂虫红酸标准品的总离子流图和选择离子监测图 _________________________________ 6 7.00 8.00 DB35/T 1338—2013 福 建 省 地 方 标 准 化妆品天然红 4 含量 测试方法 DB35/T 1338—2013 * 2013 年 8 月第一版 2013 年 8 月第一次印刷