ICS 65.020.20 B 05 备案号：49427-2016 内 蒙 DB15 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 968—2016 玉米秸秆低温高效降解复合菌系筛选方法 2016 - 03 - 15 发布 内蒙古自治区质量技术监督局 2016 - 06 - 15 实施 发 布 DB15/T 968—2016 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由内蒙古农业大学提出。 本标准归口单位：内蒙古农业大学。 本标准起草单位：内蒙古农业大学。 本标准主要起草人：高聚林、于晓芳、王振、王志刚、闹干朝鲁、胡树平、孙继颖、谢岷、苏治军、 青格尔。 I DB15/T 968—2016 玉米秸秆低温高效降解复合菌系筛选方法 1 范围 本标准规定了玉米秸秆低温高效降解复合菌系的筛选过程。 本标准适用于在4 ℃~15 ℃条件下玉米秸秆降解微生物的筛选。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纤维素酶 cellulases 在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。 3.2 纤维素酶活性 cellulase activity 1 min 释放 1 μ mol 葡萄糖所需酶量为一个单位（U/mL 或 U/g）。 3.3 滤纸酶活性 filter paper activity 1 g固体酶或1mL液体酶，在温度50 ℃±0.1 ℃，在指定pH条件下（酸性纤维素酶pH 4.8，中性纤 维素酶pH 6.0），水解滤纸底物1 h，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活单位，以U/g或 U/mL表示。 3.4 内切-β-1,4-葡聚糖酶活性 endoglucanases 1 g固体酶或mL液体酶，在温度50 ℃±0.1 ℃，在指定pH条件下（酸性纤维素酶pH 4.8，中性纤维 素酶pH 6.0），水解羧甲基纤维素钠底物1 h，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活单位， 以U/g或U/mL表示。 3.5 外切-β-1,4-葡聚糖酶活性 cellobiohydrolases 1 DB15/ T 968—2016 1 g固体酶或1 mL液体酶，在温度50 ℃±0.1 ℃，在指定pH条件下（酸性纤维素酶pH 4.8，中性纤 维素酶pH 6.0），水解脱脂棉底物1 h，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活单位，以U/g 或U/mL表示。 3.6 β-葡萄糖苷酶活性 β-glucosidase 1 g固体酶或mL液体酶，在温度50 ℃±0.1 ℃，在指定pH条件下（酸性纤维素酶pH 4.8，中性纤维 素酶pH 6.0），水解水杨苷底物1 h，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活单位，以U/g或 U/mL表示。 4 缩略语 下列缩略语适合本文件。 FPA：滤纸酶活性 (Filter paper activity)。 Cx：内切-β -1,4-葡聚糖酶活性 (Endoglucanases)。 C1：外切-β -1,4-葡聚糖酶活性 (Cellobiohydrolases)。 CB：β -葡萄糖苷酶活性 (β -glucosidase)。 5 筛选程序 5.1 菌源样品的采集 选择寒冷地区，采集富含纤维素的土壤或牛羊粪样品，每个样品采集量约 1 kg。 5.2 富集培养 将 10 %菌源样品接种到富集培养基之一中（见附录 A）进行富集培养；培养 15 d～20 d 至富集培 养基颜色变深、滤纸条或玉米秸秆溃烂，取培养液，按 5 %～10 %接种量接种到新鲜的富集培养基中继 续富集培养，如此转接富集培养 4 次～5 次。 5.3 继代培养 取富集培养后的培养液，按 5 %～10 %接种量接种到放置有滤纸条的继代培养基中（见附录 A），在 25 ℃条件下，继代培养至滤纸条黄化断裂时，记录断裂时间，并吸取断裂处培养液，转接至新的继代 培养基中，如此连续重复继代培养 5 次。 5.4 低温驯化培养 在 25 ℃条件下，继代培养至滤纸条黄化断裂时间恒定时，按每传一代降低 1 ℃的温度梯度进行低 温驯化，驯化培养温度至 4 ℃时停止。在驯化过程中选择滤纸分解情况好的培养物。 5.5 产酶培养 按 5 %～10 %接种量吸取低温驯化后的培养液，接种到产酶培养基中，在 10 ℃条件下培养 12 d， 每隔 24 h 测定纤维素酶活性。 5.6 玉米秸秆降解培养 2 DB15/T 968—2016 按 5 %～10 %接种量吸取低温驯化后的培养液，接种到玉米秸秆降解培养基中，在 10 ℃条件下培 养 15 d 后，测定秸秆降解率。 5.7 玉米秸秆低温高效降解复合菌系初筛 通过产酶试验选择保留滤纸酶活性高于 0.5（U/g 或 U/mL）和内切-β -1,4-葡聚糖酶活性、外切 -β -1,4-葡聚糖酶活性、β -葡萄糖苷酶活性高于 1.0（U/g 或 U/mL）的菌系，淘汰酶活性较低的菌系。 （酶活性测定方法见附录 B） 6 玉米秸秆低温高效降解菌系筛选指标 玉米秸秆低温高效降解微生物筛选指标见表1。 表 1 玉米秸秆降解微生物筛选指标 项目 数值范围 滤纸酶活性 ≥0.5 （U/g 或 U/mL） 内切-β -1,4-葡聚糖酶活性 ≥1.0 （U/g 或 U/mL） 外切-β -1,4-葡聚糖酶活性 ≥1.0 （U/g 或 U/mL） β -葡萄糖苷酶活性 ≥1.0 （U/g 或 U/mL） 秸秆降解率 ≥20 % （%） 注：以上项目均为最高酶活性和降解率 3 DB15/ T 968—2016 AA 附 录 A （规范性附录） 筛选复合细菌系的试验材料 A.1 仪器设备 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酸度计（精确值 0.01） 、高压蒸汽灭菌锅、电子天平(精确 值 0.001 g)、恒温干燥箱、离心机、磁力搅拌器(附加热功能)、恒温水浴锅、分光光度计、移液器(精 度为 1 μ L) A.2 试剂和材料 本标准使用的试剂均为分析纯，水均为符合 GB／T 6682 中规定的二级水。 无离子水、无菌水、蒸馏水、滤纸条、酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)、苯酚、亚硫酸钠 氢氧化钠溶液(200 g／L)：称取氢氧化钠 20.0 g，加 100 mL 水溶解。 柠檬酸溶液(0.1 mol／L)：称取柠檬酸(C6H8O7·H2O) 2.10 g，加水溶解定容至 100 mL。 柠檬酸钠溶液(0.1 mol／L)：称取柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O) 2.94 g，加水溶解定容至 100 mL。 pH 值 4.8，0.l mol/L 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.l mol/L 的柠檬酸 40 mL 与 0.l mol/L 的柠檬 酸三钠 60.0 mL 混合。 DNS 试剂：称取 3，5-二硝基水杨酸 3.15 g，加水 500 mL 搅拌溶解，水浴至 45 ℃，然后逐步加入 氢氧化钠溶液 100 mL，同时不断搅拌，直至完全溶解，再逐步加入酒石酸钾钠 91.0 g、苯酚 2.50 g 和亚硫酸钠 2.50 g，搅拌至溶解，冷却到室温后，定容至 1000 mL。过滤，取滤液贮存于棕色瓶中，避 光保存。室温下存放 7 d 后可以使用，有效期为 6 个月。 注：处理酸碱和配制 DNS 试剂时，应在通风橱或通风良好的房间进行，戴上保护眼镜和乳胶手套，一旦皮肤或眼睛 接触了上述物质，及时用大量的水冲洗。 葡萄糖标准溶液(1 mg/ mL)：精确称取 105 ℃烘至恒重的无水葡萄糖(分析纯)1.000 g，用蒸馏水 溶解后，定容至 1000 mL 容量瓶中备用。 Whatman 1 号滤纸条：称取 50 mg±0.1 mg(1.0 cm×6.0 cm)滤纸备用。 脱脂棉：称取 50 mg±0.1 mg 脱脂棉备用。 1 %羧甲基纤维素钠底物溶液：1 g 羧甲基纤维素钠加热溶于 100 mL pH 值 4.8，0.l mol/L 的柠檬 酸-柠檬酸钠缓冲液中。 0.5 %水杨苷溶液：0.5 g 水杨苷加热溶于 100 mL pH 值 4.8，0.l mol/L 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲 液中。 A.3 培养基 A.3.1 富集培养基 A.3.1.1 富集培养基1 硫酸铵 2.0 g/L。 磷酸氢二钾 1.0 g/L。 4 DB15/T 968—2016 七水硫酸镁 0.05 g/L。 碳酸钙 2.0 g/L。 氯化钠 0.2 g/L。 滤纸条 1 cm×10 cm。 玉米秸秆 5 g/L(1 cm～2 cm 茎秆)。 无菌水 1 L。 A.3.1.2 富集培养基2 蛋白胨 5 g/L。 酵母提取粉 1 g/L。 氯化钠 5 g/L。 玉米秸秆 5 g/L(1 cm～2 cm 茎秆)。 滤纸条 1 cm×10 cm。 无菌水 1 L。 A.3.2 继代培养基 硫酸铵 2.0 g/L。 磷酸氢二钾 1.0 g/L。 七水硫酸镁 0.0 5g/L。 碳酸钙 2.0 g/L。 氯化钠 0.2 g/L。 玉米秸秆 5 g/L(1 cm～2 cm 茎秆)。 无菌水 1 L。 A.3.3 产酶培养基 蛋白胨 0.5 g/L。 硫酸铵 2.0 g/L。 磷酸氢二钾 1.0 g/L。 尿素 0.6 g/L。 七水硫酸镁 0.05 g/L。 七水硫酸锰 0.016 g/L。 七水硫酸锌 0.017 g/L。 氯化钙 0.02 g/L。 氯化钠 0.2 g/L。 无菌水 1 L。 A.3.4 玉米秸秆降解培养基 玉米秸秆 50 g/L(1 cm～2 cm 茎秆)。 硫酸铵 15 g/L。 尿素 3 g/L。 蛋白胨 3 g/L。 氯化钙 0.1 g/L。 七水硫酸镁 5 g/L。 5 DB15/ T 968—2016 磷酸氢二钾 1 g/L。 氯化钠 0.1 g/L。 七水硫酸铁 0.05 g/L。 七水硫酸锰 0.016 g/L。 七水硫酸锌 0.014 g/L。 氯化钴 0.02 g/L。 无菌水 1 L。 6 DB15/T 968—2016 BB 附 录 B （规范性附录） 复合菌系降解效果测定方法 B.1 复合菌系纤维素酶活性测定 B.1.1 样品的制备 B.1.1.1 液体样品 取 2 mL～5 mL 液体样品，于 4 ℃、6000 rpm/min 离心 10 min，上清液即为粗酶液。 B.1.1.2 固体样品 称取