ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2469—2018 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 四川省质量技术监督局 2018 - 05 - 01 实施 发 布 1 DB51/T 2469—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 1 5 设备和器械 ........................................................................ 2 6 临床检查 .......................................................................... 2 7 实验室样品采集 .................................................................... 2 8 细菌分离与纯化 .................................................................... 2 9 细菌鉴定 .......................................................................... 2 10 结果判定 ......................................................................... 4 11 综合判定 ......................................................................... 5 附录 A（规范性附录） 试剂配方 ........................................................ 6 附录 B（资料性附录） 海豚链球菌 lctO 基因参考序列（870bp） ............................ 9 I DB51/T 2469—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、郑李平、黄小丽、陈德芳、欧阳萍、雷雪平、曹师琪。 II DB51/T 2469—2018 鲟鱼海豚链球菌病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了鲟鱼海豚链球菌病诊断的术语与定义、试剂和材料、设备和器械、临床检查、实验室 样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。 本标准适用于施氏鲟 (Acipenser schrenckii) 、西伯利亚鲟 (Acipenser baerii) 、俄罗斯鲟 ( Acipenser gueldenstaedtii ) 等鲟鱼海豚链球菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652 致病性嗜水气单胞菌检测方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7201.1 鱼类细菌病检疫技术规程 第1部分：通用技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 鲟鱼海豚链球菌病 指由海豚链球菌(Streptococcus iniae)感染引起的鲟鱼发病或死亡的一种细菌性疾病。 3.2 BHI Brain Heart Infusion 脑心浸液琼脂培养基。 3.3 基因 lctO lactate oxidase 乳酸氧化酶基因。 4 4.1 试剂和材料 试剂、染色液与培养基 1 DB51/T 2469—2018 2+ 按 GB/T 4789.28、GB/T 18652、SC/T 7014 规定执行。Taq酶、dNTPs、10×PCR缓冲液（无Mg ）、 DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录 A。 4.2 水 应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。 4.3 引物 lctO 基 因 序 列 扩 增 引 物 ， P1-F ： 5'-AAGGGGAAATCGCAAGTGCC-3', P2-R ： 5'-ATATCTGATTGG GCCGTCTAA-3' - 20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳、酒精灯、普通光学显微镜、电子天平、高压灭菌锅、 恒温培养箱、超净工作台、普通冰箱、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、离心管和PCR管、水 平电泳系统和凝胶成像系统等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼摄食减少或停止摄食，体色发黑，游动缓慢，偶见间隙性的狂游或旋游。 6.2 外部检查 病鱼体表、胸鳍基部、口腔周围出血，肛门红肿，外突；部分病鱼腹部膨大，体表出现溃疡，或无 明显外部病变。 6.3 剖检 肝肿大，发黄，质地变脆，或弥散性出血，呈花斑状；脾、肾肿大，呈紫色；肠道充血，肠壁变薄， 肠腔内充满黏液；脑肿胀，脑膜淤血；部分病鱼腹腔内积有淡红色腹水；鳃与其他组织无明显病变。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 的规定执行。 8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，从病鱼的肝、肾及脑中直接取样，按常规法划线接种脑心浸液琼脂培养基（Brain Heart Infusion, BHI）（A.1）。28℃培养36h～48h后，挑取表面光滑、微隆起、针尖大小、边缘整齐 的淡黄色优势菌落划线接种在BHI平板进行纯化培养。 9 细菌鉴定 2 DB51/T 2469—2018 9.1 革兰氏染色 按 GB/T 4789.28 中2.2的规定执行。 9.2 生理生化试验 9.2.1 精氨酸双水解酶试验 将待检菌穿刺接种在精氨酸双水解酶培养基（A.2）上。28℃培养48h。菌落周围培养基出现粉红色 晕圈为阳性，无粉红色晕圈为阴性。 9.2.2 七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基平板（A. 3）上，35℃培养24h。培养基变黑为阳性；不变为阴性。 9.2.3 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的1％水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性； 不变色为阴性。 9.2.4 马尿酸钠水解试验 将0.4ml待检菌液加1%马尿酸钠水溶液混合后，35℃培养2h；加入0.2ml茚三酮试剂（A. 4）振摇， 观察颜色变化。出现紫色为阳性；无颜色改变为阴性。 9.2.5 过氧化氢酶试验 按 SC/T 7014 中表2的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。 9.2.6 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按SC/T 7014表2的乙酰甲基甲醇（V-P）试验的规定执行。培养基下层出现红色为阳性，不出现红 色为阴性。 9.2.7 糖、醇类（L—阿拉伯糖、菊糖、核糖、乳糖、D-甘露醇、山梨醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A. 5），28℃培养24h后观察。培养基变黄为阳性， 不变黄为阴性。 9.3 9.3.1 lctO 基因特异性鉴定 细菌基因组 DNA 提取 取2mL待检菌培养液，12000 r/min离心1min，收集菌体； 菌体悬浮于500μL TE缓冲液（pH8.0）（A. 6），震荡悬浮，加入50μL 10％的SDS溶液（A. 7），10μL 20mg/mL的蛋白酶K（A. 8），混匀，37℃ 温育1h；加入100μL 5mol/L的NaCl溶液（A. 9），充分混匀，再加入100μL CTAB/NaCl溶液（A. 10） 混匀，65℃温育20min；加入等体积的酚﹕氯仿﹕异戊醇（25:24:1）（A. 11），混匀，12000 r/min 离心5min；取上清液加入等体积的氯仿﹕异戊醇（24:1）（A. 12），混匀，12000 r/min离心5min；取 上清液，加入1倍体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置10min，10000 r/min离心10min；沉淀用70％酒精 洗涤2次，室温晾干；加入50μL的TE缓冲液溶解，-20℃贮存，备用。 9.3.2 lctO 基因 PCR 扩增 3 DB51/T 2469—2018 2+ PCR 体系：在PCR管中加入10×PCR缓冲液（无Mg ）5.0μL，MgCl（25mmol/L） 5.0μL，dNTP（10mmol/L） 2 s 1.0μL，引物(20μmol/L)P1-F和P1-R各1.0μL，Taq DNA酶（5U/μL）0.5μL，DNA模板1.0μL，无菌双蒸水 补足至50μL。混匀后，3000 r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。 PCR扩增程序：94℃ 预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72 ℃延伸5 min；4℃保温。 9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A. 13）配制1％的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹 没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液（A. 14）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参