ICS 65.150 B 52 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 2458—2018 大鲵蛙病毒病诊断技术规程 2018 - 04 - 18 发布 四川省质量技术监督局 2018 - 05 - 01 实施 发 布 1 DB51/T 2458—2018 目 次 前 言 ............................................................................... II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂和材料 ........................................................................ 1 5 设备和器械 ........................................................................ 2 6 临床检查 .......................................................................... 2 7 实验室样品采集 .................................................................... 2 8 病毒分离 .......................................................................... 2 9 病毒鉴定 .......................................................................... 3 10 综合判定 ......................................................................... 4 附录 A（规范性附录） 试 剂 配 方 .................................................. 5 附录 B（资料性附录） 大鲵蛙病毒 MCP 基因参考序列（531bp） ............................. 6 I DB51/T 2458—2018 前 言 本标准依据 GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准中附录A为规范性附录、附录B为资料性附录。 本标准由四川省农业厅提出并归口。 本标准由四川省质量技术监督局批准。 本标准起草单位：四川农业大学。 本标准起草人：耿毅、刘丹、余泽辉、陈德芳、黄小丽、欧阳萍、邓梦玲。 II DB51/T 2458—2018 大鲵蛙病毒病诊断技术规程 1 范围 本标准规定了大鲵蛙病毒病诊断的术语与定义、试剂和材料、临床检查、实验室样品采集、病毒分 离、病毒鉴定和综合判定等技术规程。 本标准适用于大鲵蛙病毒病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于文件的应用时必不可少的。凡是注日期的应用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 SC/T 7014 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于此文件。 3.1 大鲵蛙病毒病 指由大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus，CGSRV)感染引起的大鲵发病或死亡的一 种病毒性疾病。 3.2 CPE Cytopathic effect 细胞病变效应。 3.3 EPC Epithelioma papulosum cyprini 鲤鱼上皮瘤细胞。 3.4 MCP Major capsid protein 基因 主要外膜蛋白基因。 4 试剂和材料 1 DB51/T 2458—2018 4.1 水 用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。 4.2 试剂与培养基 按 GB/T 4789.28 与 SC/T 7014 规定执行。鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）、小牛血清（FBS）、M199营 养液、青霉素、链霉素、Mix-reaction buffer、DNA分子量标准参照物与核酸提取试剂盒等选用专业试 剂公司提供的商品化试剂，上述未提及的见附录A。 4.3 引物 MCP基因序列PCR扩增引物： P1-F： 5’-GACTTGGCCACTTAGA-3’，P1-R：5’-GTCTCTGGAGAA GAGAA-3’。 - 20℃保存。 5 设备和器械 主要设备与器械如下： 解剖盘、剪刀、镊子和手术刀、组织匀浆器、电子天平、高压灭菌锅、超净工作台、普通冰箱、超 低温冰箱、一次性滤器（0.22μm）、倒置显微镜、高速冷冻离心机、微量移液器、PCR扩增仪、水平电 泳系统、凝胶成像系统与CO2培养箱等。 6 临床检查 6.1 临床症状 病鲵食欲减退，摄食减少，甚至停止摄食，部分病鲵出现呕吐，偶尔呕吐物混有血液；体表粘液分 泌增多，活动缓慢，反应迟钝，常静卧池底。 6.2 外部检查 病鲵全身性肿胀、出血，尤其头部与四肢明显，体表皮肤与肌肉溃烂，形成溃疡，严重时肿胀的四 肢溃烂。 6.3 剖检 口腔黏膜偶见出血与溃疡；腹腔常见淡黄色澄清或含血液体；肝肿大，淤血、出血，呈花斑状；脾 肿大，严重瘀血呈紫黑色或散在灰白色坏死灶；肾肿大，斑点状出血；肺囊充血、出血；胃肠道呈出血 性－卡他性炎。 7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7103 与 GB/T18088 执行。体长≤5cm的大鲵苗取整条，体长5-10cm的大鲵苗取 内脏（包括肾），体长≥10cm的大鲵则取肝、脾、肾。 8 病毒分离 8.1 2 样品处理 DB51/T 2458—2018 应在10℃以下进行。先用组织研磨器将样品匀浆，再用细胞培养液PBS缓冲液(A.1)按1:10的最终稀 释度组织悬液，加入100IU/ml双抗（青霉素、链霉素A.2）后，置4℃冰箱作用1-2h后，反复冻融3次， 用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，滤液保存于﹣20℃或以下温度冷冻保存。 8.2 细胞接种与观察 将上述滤液用细胞培养液(A.3)再做两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100、1:1000三种稀释度的滤 液，分别接种到生长24-48h的EPC单层细胞，按每2cm2的细胞单层接种100μL，的中，25°C吸附1-2h后弃 病毒液，然后加含2% FBS和100IU/ml双抗的M199细胞培养维持营养液(A.4)，置于25°C培养。接种滤液 后的细胞，7d内每天用倒置显微镜观察CPE出现情况。典型的CPE为细胞空泡、变圆、脱落。若细胞出现 CPE，收集细胞液进行鉴定。若细胞在接毒后7d未出现CPE，盲传一次，再培养观察7d，未出现CPE的样 品则判定为阴性。 9 9.1 病毒鉴定 样品处理 对有临床症状的大鲵，按8.1的要求取样匀浆后取50mg-100mg于1.5ml EP管中；对出现CPE的细胞培 养样品取450μL于1.5ml EP管中。用CGSRV核酸作为阳性对照，无感染CGSRV大鲵正常组织或无病毒感染 的细胞培养物为阴性对照，用等体积的双蒸水作为空白对照。 9.2 DNA 提取 DNA提取可使用商品化的组织病毒DNA抽提试剂盒(按说明书操作)，或使用传统酚-氯仿提取法，具 体操作如下（传统法）： a) 将样品置于-40℃冰箱反复冻融 3 次，12000r×5min； b) 取上清 400μl，加入 500μl tris-饱和酚，充分混合，静置 5min，12000r×5min，4 ℃； c) 取上清加入饱和酚，氯仿各 200μl，混匀，静置 5min，12000r×5min，4℃。重复一次； d) 取上清加入 200μl 氯仿，混匀，12000r×5min，4℃，此时将出现分层。如果中层蛋白多，则 重复上一步骤； e) 取上清加 1-2 倍体积的异丙醇，轻轻混匀，室温静置 20min，12000r×5min，4℃； f) 弃上清，用 75%酒精洗涤，12000r×5min，4℃，重复操作一次； g) 弃上清，操作台中自然晾干后，20-30μlTE 溶解沉淀，-20℃保存，备用。 9.3 PCR 扩增反应 在PCR管中加入12.5μl Mix-reaction buffer，上下游引物各 1μl（10umol/L），DNA模板 1μl， 加入 9.5μl 无菌双蒸水至 25μl 体积。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。混匀 后，3000r/min离心30s。 将PCR管置于PCR仪，按下列程序进行PCR 扩增：94℃预变性 4mim，94℃变性 1min，55℃退火 1min， 循环30 次，最后 72℃延伸 1min，最后在 72℃延伸 10min，4℃保存。 9.4 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A .5）配制1％的琼脂糖（A .6）平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液 （A .7）刚好淹没胶面。将上述6μL样品和2μL溴酚蓝指示剂溶液（A.8）混合后加入样品孔，使用DNA 分子量标准参照物作对照。120V电泳约20-40min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察。 3 DB51/T 2458—2018 9.5 结果判定 阳性对照出现约500bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该扩增条带。待测样品出现约500bp的 扩增带，则判定为阳性如果扩增的DNA条带大小与阳性片段接近难以确定，则需要对PCR扩增产物进行纯 化与测序，若对PCR扩增产物纯化、测序，并与已知序列（附录B）比对，同源性达98%以上则为阳性， 否则为阴性。 10 综合判定 有临床症状，满足以下任何一条都可以确诊为CGSRV阳性，判定患大鲵蛙病毒病。 a) 细胞培养出现典型 CPE，PC