B22 张 DB1307 家 口 市 地 方 标 准 DB1307/T 300—2020 “张杂谷”品种分子鉴定技术规程 2020-01-06 发布 张家口市市场监督管理局 2020-01-21 实施 发布 DB1307/T 300—2020 前 言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由张家口市农业科学院提出。 本标准起草单位：张家口市农业科学院、北京市农林科学院、河北巡天农业科技有限公司。 本标准主要起草人：赵治海、魏玮、李双东、范光宇、王凤格、赵久然、易红梅、王蕊、叶世峰、 李素军、朱成平、刘粤阳、杨建勇、赵芳、张晓磊、冯小磊、王晓明、王峰、史高雷、宋国亮、王德权、 张雅莉、李欣儒、张文英、邱风仓、裴晶晶。 DB1307/T 300—2020 “张杂谷”品种分子鉴定技术规程 1 范围 本标准规定了采用微卫星标记进行“张杂谷”品种分子鉴定的术语和定义、原理、仪器设备、试剂 及溶液配制、引物信息、参照品种信息、操作程序、数据记录与统计、判定规则等技术要求。 本标准适用于“张杂谷”品种分子鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 核心引物 品种鉴定中优先选用的一套 SSR（simple sequence repeat）引物，具有多态性高、重复性好等特点。 2.2 参照品种 所用的 SSR 标记能够扩增出稳定、清晰、可辨的等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样 品的等位变异，校正实验操作、仪器设备的系统误差。 3 原理 由于不同谷子品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，利用微卫星标 记技术可鉴定不同谷子品种及来源。 4 仪器设备 仪器设备见附录A。 5 试剂及溶液配制 试剂及溶液配制见附录B。 6 引物信息 引物信息核心引物名单及序列表见附录C，核心引物等位变异等相关信息见附录D。 7 参照品种信息 参照品种信息见附录E。 1 DB1307/T 300—2020 8 操作程序 8.1 取样 送验样品可为种子、幼苗、叶片、果穗等组织或器官。对谷子材料随机数取至少5个个体组成混合 样品进行分析。 8.2 DNA 提取 8.2.1 CTAB 提取法：幼苗或叶片约 200 mg ~300 mg，置于 2.0 mL 离心管，加液氮冷冻，充分研磨，或 取种子充分磨碎，移入 2.0 mL 离心管；每管加入 700 µL 65 ℃预热的 CTAB 提取液后，充分混合，65 ℃ 保温 60 min，期间多次颠倒混匀；每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后，静置 10 min； 12 000 rpm 离心 15 min，取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，-20 ℃放置 30 min； 4 ℃，12 000 rpm 离心 10 min，弃上清液；加入 70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立 于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀 6 h 以上；加入 100 µL 超纯水或 TE 缓冲液，充分溶解后备用。 8.2.2 也可使用其它达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法。 8.3 PCR 扩增 8.3.1 引物选择 首先选择附录C中第1~18对引物进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用附录C中 第19~36对引物进行检测。 8.3.2 反应体系 各组分的终浓度如下：每种dNTP 0.10 mmol/L，上游、下游引物各0.24 mol/L，Taq DNA聚合酶0.04 U/ l ，1倍PCR缓冲液（含Mg2+ 2.5 mmol/L），DNA浓度2.5ng/ l，其余以超纯水补足至所需体积。 8.3.3 反应程序 94 ℃预变性5 min，1个循环；94 ℃变性40 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延 伸10 min，4 ℃保存。 8.4 PCR 产物检测 8.4.1 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法 8.4.1.1 清洗玻璃板 用清水沾洗涤灵将玻璃板反复擦洗干净，双蒸水擦洗两遍，95%乙醇擦洗两遍，干燥。在长板上涂 上0.5 mL 亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5 mL 剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互 相污染。 8.4.1.2 灌胶 在100 mL 4.5% PAGE胶中加入TEMED和25%过硫酸铵各100  L，迅速混匀后灌胶。待胶流动到下 部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合1h以上。灌胶时应匀速防止出现气泡。 8.4.1.3 预电泳 在正极槽（下槽）中加入1倍TBE缓冲液600 mL，在负极槽（上槽）加入预热至65℃的1倍TBE缓冲 液600 mL，拔出梳子。90W恒功率预电泳10~20 min。 2 DB1307/T 300—2020 8.4.1.4 变性 在20L PCR产物中加入4 L 6倍加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95 ℃变性5 min， 4 ℃冷却10 min以上。 8.4.1.5 电泳 用移液器吹吸加样槽，清除气泡和杂质，插入样品梳子。每一个加样孔点入 5 l 样品。80W 恒功 率电泳至上部的指示带（二甲苯青 FF）到达胶板的中部。电泳结束后，分开两块玻璃板。 注：预期扩增产物片段大小在150 bp以下时电泳时间应适当缩短，扩增产物片段大小在300 bp以上时电泳时间应适 当延长。 8.4.1.6 银染 银染按以下步骤进行： a）固定：固定液中轻轻晃动 3 min； b）漂洗：双蒸水快速漂洗 1 次，不超过 10 s； c）染色：染色液中染色 5 min； d）漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过 10 s； e）显影：显影液中轻轻晃动至带纹出现； f）定影：固定液中定影 5 min； g）漂洗：双蒸水漂洗1 min。 8.4.2 荧光标记毛细管电泳 8.4.2.1 样品制备 等体积混合不同荧光SSR标记（FAM，ROX）扩增产物，混匀后从混合液中吸取1 L加入到DNA 分析仪专用96孔板孔中。板中各孔分别加入0.1 L分子量内标和8.9 L去离子甲酰胺。将样品在PCR仪 上95 ℃变性5 min，取出，立即置于碎冰上，冷却10 min以上。离心10 s后置放到DNA分析仪上。 8.4.2.2 电泳检测 按照仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。 9 数据记录与统计 9.1 数据记录 对普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将每个扩增位点的等位变异与参照品种的等位变异片段大小进行 比较，确定样品在该位点的等位变异；对荧光标记毛细管电泳，通过参照品种消除同型号不同批次间或 不同型号 DNA 分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取样品在该位点的等位变异。 纯合位点的基因型数据记录为 X/X，杂合位点的基因型数据记录为 X/Y，其中 X、Y 分别为该位点 上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为 0/0。 示例 1：样品在某个位点上仅出现一个等位变异，为 150，在该位点的基因型记录为 150/150； 示例2：样品在某个位点上有两个等位变异，分别为150、160，在该位点的基因型记录为150/160。 9.2 数据统计 当对送验样品混合 DNA 进行分析时，可直接进行品种间成对比较，如果样品某个引物位点出现可 3 DB1307/T 300—2020 见的异质性且影响到差异位点判定时，可重新提取至少 20 个个体的 DNA，并用该引物重新扩增，统计 在该引物位点上不同个体的基因型（或等位变异）及所占比例。当对送检样品多个个体 DNA 进行分析 时，应统计其在各引物位点的各种基因型（或等位变异）及所占比例。对单交种，应比较两个样品在各 引物位点的基因型；对自交系，应比较两个样品在各引物位点的等位变异。 成对比较的数据统计记录表见附录F。 10 判定规则 10.1 结果判定 当样品间差异位点数≥2，判定为“不同”；当样品间差异位点数＝1，判定为“近似”；当样品间 差异位点数＝0，判定为“极近似或相同”。 对利用附录C中36对引物仍未检测到≥2个差异位点数的样品，如果相关品种存在特定标记，必要时 增加其特定标记进行检测。 10.2 结果表述 比较位点数： 定为： 。 ，比较位点为： ；差异位点数： ，差异位点为： ；判 4 AA DB1307/T 300—2020 附 录 A （规范性附录） 主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 A.1.1 PCR扩增仪 A.1.2 高压电泳仪 规格为3000V、400mA、400W，具有恒电压、恒电流和恒功率功能。 A.1.3 垂直电泳槽及配套的制胶附件 A.1.4 普通电泳仪 A.1.5 水平电泳槽及配套的制胶附件 A.1.6 高速冷冻离心机 最大离心力不小于15 000 rpm，-10 ℃~30 ℃。 A.1.7 水平摇床 A.1.8 胶片观察灯 A.1.9 电子天平 感应为0.01 g、0.001 g。 A.1.10 微量移液器 规格分别为10 L、20 L、100 L、200 L、1000 L，连续可调。 A.1.11 磁力搅拌器 A.1.12 紫外分光光度计 波长260 nm 及280 nm。 A.1.13 微波炉 A.1.14 高压灭菌锅 A.1.15 酸度计 A.1.16 水浴锅或金属浴 控温精度±1 ℃。 A.1.17 冰箱 最低温度-20 ℃。 5 DB1307/T 300—2020 A.1.18 制冰机 A.1.19 凝胶成像系统或紫外透射仪 A.1.20 DNA分析仪 基于毛细管电泳，有片段分析功能和数据分析软件，能够分辨1个核苷酸大小的差异。 6 BB DB1307/T 300—2020 附 录 B （规范性附录） 溶液配制 B.1 主要试剂 B.1.1 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB） B.1.2 三氯甲烷 B.1.3 异丙醇 B.1.4 异戊醇 B.1.5 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O） B.1.6 三羟甲基氨基甲烷（Tris-base） B.1.7 盐酸（HCI） ：37 % B.1.8 氢氧化钠（NaOH） B.1.9 氯化钠(NaCl) B.1.10 10倍 PCR Buffer缓冲液 含Mg2+ 25 mmol/L B.1.11 四种脱氧核苷三磷酸 dATP、dTTP、dGTP、dCTP（每种10 mmol/L） B.1.12 Taq DNA聚合酶 B.1.13 矿物油 B.1.14 琼脂糖 B.1.15 DNA分子量标准 B.1.16 核酸染色剂 B.1.17 去离子甲酰胺 B.1.18 溴酚蓝 B.1.19 二甲苯青FF B.1.20 甲叉双丙烯酰胺 B.1.21 丙烯酰胺 B.1.22 硼