ICS 67.120.01 B 45 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1847—2020 黄羊源性成分检测 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Detection of Procapra Gutturosa - Derived Materials 2020-02-25 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-03-25 实施 发 布 DB15/T 1847—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国二连海关。 本标准主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、寇福军、张志峰、荆文魁、常鸿。 I DB15/T 1847—2020 黄羊源性成分检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了动物源性产品中黄羊源性成分实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于动物源性产品（肉制品、皮毛类产品、饲料等）中黄羊源性成分的鉴定，灵敏度为 0.001ng/L。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB/T 5009.1 食品卫生检验方法 理化部分 总则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵。 3.2 EDTA 乙二胺四乙酸。 3.3 Real–time PCR 实时荧光定量聚合酶链式反应。 3.4 Tris-HCl 三氨基甲烷。 4 设备 4.1 4.2 4.3 4.4 实时荧光 PCR 检测系统。 高速台式冷冻离心机（最高转速 12000 rpm 以上）。 离心机。 旋涡振荡器。 1 DB15/T 1847—2020 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 单孔道微量移液器和枪头：0.5 L～10 L、10 L～100 L、20 L～200 L、100 L～1000 L。 EP 离心管。 刻度量筒：100 mL，500 mL，1000 mL。 试剂瓶和洗涤瓶：500 mL。 天平。 5 试剂与材料 5.1 水：符合 GB/T6682 分析实验室二级水规格。 5.2 试剂盒：按说明书使用试剂盒提供的相应试剂。 5.3 自备的试剂：CTAB 提取缓冲液（十六烷基三甲基溴化铵），CTAB-沉淀液，蛋白酶 K（1.2 mol/L） 氯化钠。 5.4 实时荧光预混液。 5.5 引物对序列 -上游：5’-CTAGGCAACATGCATATC-3’ -下游：5’-CGAGAAGAGAAATCCTTG -3’ -探针序列：5’-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TAMRA-3’ 5.6 质控物质 5.6.1 阳性对照样品：采用已知含有黄羊源性成分的样品或经测序确认的阳性质粒。 5.6.2 阴性对照样品：采用已知不含有黄羊源性成分的样品。 5.6.3 空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。 6 实验方法 6.1 样品的选取与制备 动物源性食品按照 GB/T 5009.1 和 GB 4789.1 采样。将实验室样品研磨待用。 6.2 样品 DNA 的提取 参照附录A中方法提取样品基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当A260 /A280比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。除检测样品外，需要设立阴性、阳性及空白对照。 6.3 实时荧光 PCR 检测 6.3.1 反应体系 反应体系体积为25 L，体系组成见表1。 2 DB15/T 1847—2020 表1 黄羊源性成分实时荧光PCR检测方法的反应体系 贮备液浓度 反应体系体积 mol/L L PCR 反应预混合液 — 12.5 上游引物（F） 10 1 下游引物（R） 10 1 探针（P） 10 1 模板 — 2 双蒸水 — 补足至总体积为 25 试剂名称 6.3.2 反应条件 预变性：94 ℃，10 min；变性： 94 ℃，15 s；延伸退火：58 ℃，1 min，40 个循环。在 58 ℃ 时收集荧光信号值。 6.3.3 检测过程 分别设阴性对照、阳性对照和空白对照。 7 结果判定与表述 7.1 质量控制 7.1.1 一般要求 实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果， 应重做试验。 7.1.2 核酸提取空白对照和 PCR 扩增试剂空白对照 检测结果Ct≥40.0 7.1.3 PCR 扩增阴性目标 DNA 对照 检测结果Ct≥40.0 7.1.4 PCR 扩增阳性目标 DNA 对照 检测结果Ct≤35.0 7.2 结果判断和报告 7.2.1 样品 2 个平行样检测结果 Ct≥40.0，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品结果为阴性， 报告未检出黄羊源性成分。 7.2.2 样品至少 1 个平行样检测结果 35.0﹤Ct﹤40.0，并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结 果正常，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。再次检测结果仍然 Ct﹤40.0 并出现典型 的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出黄羊源性成分，报告检出黄羊源性成分； 再次检测结果仍然 Ct≥40.0 同时各种试验对照结果正常，可以判断样品未检出黄羊源性成分，报告未 检出黄羊源性成分。 3 DB15/T 1847—2020 7.2.3 样品 2 个平行样品检测结果 Ct≤35.0 并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可 以判断样品检出黄羊源性成分，报告检出黄羊源性成分。 8 防止交叉污染措施 按照GB/T 19495.2 防止检测过程中交叉污染。 4 DB15/T 1847—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 样品 DNA 的提取及溶液配制 A.1 CTAB-提取缓冲液 将5 g CTAB，20.45 g NaCL，3.03 g Tris，1.86 g Na2-EDTA溶于200 mL水中，用盐酸调pH 8.0后， 定容至250 mL，115 ℃高压15 min。 A.2 CTAB-沉淀液 称0.2 g CTAB，0.234 g NaCL，定容至100 mL，115 ℃高压15 min。 A.3 蛋白酶K 按试剂说明配制。 A.4 1.2 mol/L NaCL溶液 称取28 g NaCL，定容至400 mL，115 ℃高压15 min。 A.5 DNA提取方法 A.5.1 称取样品0.5 g～1 g加入1.5 mL～3.5 mL CTAB提取液中，再加入12 L～20 L蛋白酶K（根据 CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白对照。混匀后65 ℃至少1 h(过夜孵育最好)，如样 品膨胀，则可再多加CTAB，每次多1 mL，最多10 mL。 A.5.2 低温4000 rpm～5000 rpm离心10 min。 A.5.3 将上清（约1 mL）加入无菌EP中（2 mL管），加入700 L氯仿，旋涡30 s后，再12000 rpm离 心10 min。 A.5.4 取上清600 L～650 L加入无菌EP中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1 min。 A.5.5 12000 rpm离心10 min，去上清。沉淀溶解于350 L的1.2 mol/L NaCL溶液。（2管合并共用350 L溶液）。 A.5.6 加入350 L氯仿，涡旋30 s，再12000 rpm离心10 min。 A.5.7 取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20 min,12000 rpm离心10 min，去上清，沉淀用500 L 75%的乙醇洗涤，再12000 rpm离心10 min。 A.5.8 去上清后，干燥沉淀，60 ℃下15 s～20 s（开盖倒立）。 A.5.9 将沉淀溶于100 L灭菌水或TE Buffer或DEPC水中。 B 5 DB15/T 1847—2020 附 录 B （资料性附录） 黄羊源性成分的目标扩增序列大小 94bp CTAGGCAACATGCATATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATGACCATGCCGCGTGAAACCAACAACCCGCTCGGCAAGGATTTCTCT TCTCG _________________________________ 6