ICS 65.020.30 B 41 DB51 四 川 省 地 方 标 准 DB 51/T 2665—2019 种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化技术规范 2019 - 12 - 30 发布 四川省市场监督管理局 2020 - 02 - 01 实施 发 布 DB51/T 2665—2019 目 次 前言 ................................................................................. I 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化程序 ...................................................... 1 5 种鸡场鸡白痢沙门氏菌抗体阴性鸡群的维持 ............................................ 2 6 种鸡场鸡白痢沙门氏菌的净化指标 .................................................... 2 附录 A （资料性附录） 鸡白痢沙门氏菌 PCR 检测流程 .................................... 4 I DB51/T 2665—2019 前 言 本标准依据GB/T 1.1－2009 给出的规定进行编写。 本标准由四川省农业农村厅提出并归口。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准起草单位：四川大学。 本标准起草人：王红宁、张安云、雷昌伟、唐艺芝、杨鑫、孟延发。 II DB51/T 2665—2019 种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化技术规范 1 范围 本标准规定了种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化程序、鸡白痢沙门氏菌阴性鸡群维持以及净化指标。 本标准适用于四川省行政范围内种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化技术指导。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4789.4 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的测定 GB/T 5750.2 生活饮用水标准检验方法 水样的采集与保存 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY/T 2838 禽沙门氏菌病诊断技术 NY/T 536 鸡伤寒和鸡白痢诊断技术 DB 51/T 1286 规模化鸡场消毒技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸡白痢 是由鸡白痢沙门氏菌引起的以2-3周龄雏鸡下痢和败血症为特征的传染病。初期病鸡仅表现食欲减 少，继而不食；腹泻，排白色稀浆样粪便，有糊堵肛门现象；严重者因呼吸困难或急性败血症而死亡。 3.2 净化 为达到消灭和清除传染源的目的，在某一限定地区或养殖场内采取的一系列措施。 4 种鸡场鸡白痢沙门氏菌净化程序 4.1 总体原则 4.1.1 持续开展鸡白痢沙门氏菌病原学检测、抗体检测，淘汰带菌鸡或鸡群。 4.1.2 强化本场引种和投入品的检测，避免外来病原传入风险。 4.1.3 采取严格的生物安全措施，建立完善的防疫和生产管理等制度，对饮水、空气、饲料、粪便、 鼠、苍蝇等进行鸡白痢沙门氏菌检测，构建持续有效的生物安全防控体系。 1 DB51/T 2665—2019 4.2 转群、开产前鸡白痢沙门氏菌抗体检测 种鸡场从无白痢鸡场引种后，在90-120日龄，采用NY/T 536全血平板凝集试验检测沙门氏菌抗体， 祖代鸡100%进行检测。父母代公鸡100%全检，父母代母鸡的检测比例如下：养殖规模≥30万只按3 %比 例抽检，10万只≤养殖规模＜30万只，按4 %比例抽检，10万只及以下养殖规模，按5 %比例进行抽检。 所有抗体阳性鸡或可疑阳性鸡用NY/T 2838中微量凝集法进行第二次抗体复检，两次均呈抗体阳性，则 淘汰。若抗体阳性率高于5 %，则抽检比例升至30 %，淘汰阳性鸡。若抗体阳性率高于20%，则本群鸡不 具备开展鸡白痢沙门氏菌净化的条件。 4.3 14-21 日龄和 90-120 日龄鸡粪便中鸡白痢沙门氏菌 PCR 检测 对14-21日龄和90-120日龄鸡 (单次检测不低于200只) 采集肛拭子，按照附录A对鸡白痢沙门氏菌 进行PCR检测，确定是否有鸡白痢沙门氏菌感染（若同时出现260 bp，570 bp左右两条条带，则判断为 鸡白痢沙门氏菌阳性）。对鸡白痢沙门氏菌阳性鸡进行淘汰。 5 种鸡场鸡白痢沙门氏菌抗体阴性鸡群的维持 5.1 种鸡场消毒及鸡白痢沙门氏菌检测 种鸡场日常消毒按照DB51/T 1286进行。引进雏鸡前对鸡舍及周边环境进行系统消毒，消毒后采集 鸡舍内墙角、鸡笼、地面棉拭子样品按照GB 4789.4对鸡白痢沙门氏菌进行分离鉴定，确保无鸡白痢沙 门氏菌污染。采集鸡舍外鼠、苍蝇等样品按照GB 4789.4对鸡白痢沙门氏菌进行分离鉴定，确保鸡舍周 边无鸡白痢沙门氏菌感染风险。 5.2 饮用水微生物指标检测 在鸡群饮水乳头处采集水样进行检测，每半个月检测一次。饮水取样方法按照GB/T 5750.2进行， 对沙门氏菌的检测方法按照GB 4789.4进行。对不达标的饮水通过净化处理，可采用酸化剂（酸性电解 水等）进行饮水消毒，使饮水达到NY 5027要求。不同企业水的净化处理方案必要时根据实际情况，通 过实验确定。参照附录A的方法对沙门氏菌病原进行检测。 5.3 饲料中沙门氏菌检测 监测每批蛋白类饲料原料和饲料成品，饲料中沙门氏菌检测按照GB/T 13091进行。检测不合格原料 和成品不能使用。 5.4 空气中细菌总数检测 对鸡舍空气中细菌总数进行检测，取样及检测方法按照DB51/T 1286进行，空气中细菌数不超过 3 25000 CFU/m 为合格。并根据鸡场实际情况根据实验测定结果制定出个性化的消毒程序。 5.5 沙门氏菌抗体检测 在开产后每隔3个月，采用全血平板凝集试验检测沙门氏菌抗体，按0.5 %比例抽检。方法按照NY/T 536进行初筛，阳性样本采用NY/T 2838进行确诊。阳性率若高于2 %，则抽检比例升至10 %，淘汰阳性 鸡。 6 种鸡场鸡白痢沙门氏菌的净化指标 2 DB51/T 2665—2019 祖代种鸡场鸡白痢血清学阳性率低于0.2%；父母代种鸡场鸡白痢血清学阳性率低于1%；种公鸡的鸡 白痢血清学全部为阴性；鸡白痢沙门氏菌PCR检测全部为阴性；连续两年以上无临床病例，即认为达到 鸡白痢净化状态。 3 DB51/T 2665—2019 AA 附 录 A （资料性附录） 鸡白痢沙门氏菌 PCR 检测流程 采集新鲜肛拭子样品放入装有3 mL 缓冲蛋白胨水的无菌EP管中，于36℃，160 r/min培养18 h。轻 轻摇动培养物，移取1mL接种于10mL氯化镁孔雀绿增菌液中，42℃培养24 h。取1mL增菌液采用煮沸法制 备细菌DNA模板，PCR特异性引物见表1，PCR反应体系和反应条件见表2。取2 μL PCR产物用1% 琼脂糖凝 胶于0.5×TAE缓冲液中进行电泳检测。鸡白痢沙门氏菌可见573、260bp两条带，其余沙门氏菌仅见260bp 一条带，非沙门氏菌无扩增条带（图1）。 表A.1 沙门氏菌及鸡白痢血清型特异性引物序列表 目标序列 沙门氏菌属特异性序列 鸡白痢/鸡伤寒特异性序列 引物 序列 扩增片段长度（bp） STN-F 5’-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3’ STN-R 5’-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3’ SEP-F 5’-CACTGGAGACTCTGAGGACAA-3’ SEP-R 5’-GGATTGATGAGGCTAACAAGGA-3’ 260 573 表A.2 沙门氏菌及鸡白痢血清型特异性 PCR 反应体系和反应条件 试剂 添加量 反应条件 引物SEP-F、SEP-R（10 μmol） 各0.5μL 引物STN-F、STN-R（10 μmol） 各0.5μL 2×Taq PCR MasterMix 10μL 超纯水 6μL 模板DNA 2μL 合计 20μL 95℃预变性10 min； 94℃变性30 s 57℃退火30 s 72℃延伸30 s 72℃终延伸10 min； 4℃保存。 图A.1 沙门氏菌 PCR 电泳结果 （1-2：鸡白痢沙门氏菌；3-10依次为肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌、甲型副伤寒沙门 氏菌、海德堡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、纽波特沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌；11：奇异变形杆菌； 12：埃希氏大肠杆菌；13：粪肠球菌；14：金黄色葡萄球菌；15：阴沟肠杆菌；16：空肠弯曲杆菌； 17：普通变形杆菌；18：唾液乳酸杆菌；19：超纯水） _________________________________ 4