ICS 65.020.01 B 34 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 2034—2019 甘蔗茎尖脱毒组培苗繁育技术规程 Technical specification for sugarcane virus-free tissue culture seedling from shoot tip rapid propagation 2019 - 12 - 05 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2019 - 12 - 30 实施 发 布 DB45/T 2034—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区糖业办公室提出并监督实施。 本标准由广西糖业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人：刘丽敏、刘红坚、李松、何为中、刘俊仙、翁梦苓、卢曼曼、何毅波、张伟珍。 I DB45/T 2034—2019 甘蔗茎尖脱毒组培苗繁育技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗茎尖脱毒组培苗繁育技术的术语和定义、缩略语、实验室仪器设备试剂、培养基 的配方及配置、茎尖培养、脱毒检验、继代增殖培养、生根培养、假植、假植苗质量要求及检验方法和 假植苗包装、销售与运输。 本标准适用于广西境内甘蔗茎尖脱毒组培苗的繁育技术。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 22278 良好实验室规范原则 GB/T 36829 甘蔗宿根矮化病菌 实时荧光PCR检测方法 NY/T 1796 甘蔗种苗 NY/T 1804 甘蔗花叶病毒检测技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 甘蔗茎尖脱毒 shoot apex virus-free 利用甘蔗茎尖顶端分生组织及其周缘部分培养组培苗，而使其脱除花叶病、宿根矮化病等病原菌的 方法。 3.2 外植体 explant 从甘蔗腋芽苗中切取下来进行培养获得无菌苗的茎尖分生组织称为外植体。 4 缩略语 MS：MS培养基（Murashige & Skoog(1962)） PVP：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone） ScMV：甘蔗花叶病(Sugarcane mosaic disease) SrMV：高梁花叶病(Sorgh ummosaicvirus) RSD：甘蔗宿根矮化病( Ratoon stunting disease) 1 DB45/T 2034—2019 5 实验室、仪器设备、试剂 5.1 实验室 应符合GB 19489和GB/T 22278规定。 5.2 仪器设备 主要的仪器设备如下:压力蒸汽灭菌器、恒温水浴锅、空调、超净工作台、体视显微镜（双筒解剖 镜）、接种针、接种刀、长柄枪型镊子、封口机等。 5.3 试剂 甘蔗茎尖脱毒组培苗繁育常用化学试剂见附录A。 6 培养基的配方及配制 6.1 配方 使用的培养基配方如下： a) 诱导分化培养基：MS＋6-BA1.0 mg/L＋NAA0.1 mg/L＋核黄素 15 mg/L～30 mg/L＋蔗糖 3％； b) 继代增殖培养基：MS＋6-BA0.5 mg/L～1.5 mg/L＋NAA0.05 mg/L～0.10 mg/L＋蔗糖 3％； c) 生根培养基：MS＋NAA5 mg/L～10 mg/L＋蔗糖 3％～7％。 6.2 配制 6.2.1 诱导分化培养基的配置 培养基的各个成分按6.1中 a)的配方量取后，加水定容，用1 mol/L NaOH或HCl将培养基的pH值调节 在5.8～6.0，折长宽各4 cm的四层滤纸放入培养瓶内，将培养基按每瓶10 mL的量分装到培养瓶，以培养 基不淹没滤纸为宜。 6.2.2 继代增殖培养基的配置 培养基的各个成分按 6.1中 b)的配方量取后，加水定容，用1 mol/L NaOH或HCl将培养基的pH值调节 在5.8～6.0，将培养基按25 mL/瓶的量分装至培养瓶。 6.2.3 生根培养基的配置 培养基的各个成分按6.1中 c）的配方量取后，加水定容， 用1 mol/L NaOH或HCl将培养基的pH值调 节在5.8～6.0，将培养基按30 mL/袋的量分装到规格为10 cm×13 cm的聚乙烯树脂塑料袋（培养袋）中， 每10袋为一组，每3组装在一个专门定制的铝箱内进行高压灭菌。 6.2.4 培养基的高压灭菌 将已分装好培养基的培养瓶（袋）封口并标注好配制日期和培养基种类后，置于温度为 121 ℃，压 力为 1.05 kg/cm 的灭菌锅内高压灭菌 15 min～20 min。 2 7 茎尖培养 2 DB45/T 2034—2019 7.1 母体的选择 选择品种特性特征明显、健壮、生长旺盛、无病虫害症状的蔗株作为母体材料。 7.2 温汤及催芽处理 将母体材料砍成单芽茎段，放置在干净流动的清水里浸洗48 h后，再置于52℃的恒温水浴锅中温汤 处理30 min，捞出沥干后将茎段排放在托盘内，腋芽朝上，排满整个托盘后，倒入干净的河沙，以河沙 盖过腋芽为宜，浇透水分，盖上薄膜，放入恒温培养室内进行沙培催芽。 7.3 沙培催芽管理 每天观察沙盘内腋芽生长情况，浇水以保持托盘内河沙湿润但不积水为宜，防止甘蔗茎段霉变。培 养室内温度保持在38℃～40℃，光照强度在 2 500 lx以上，培养时间为10 d～15 d。 7.4 茎尖接种诱导培养 7.4.1 外植体材料选择 待腋芽苗长至株高10 cm～15 cm，选择生长粗壮的腋芽苗作为诱导丛生芽的外植体材料。 7.4.2 腋芽苗预处理 7.4.2.1 清洗 将腋芽苗连同种茎从沙盘内挖出，用自来水冲洗干净，削去大部分种茎，只留下与腋芽苗相连的部 分茎皮，去除腋芽苗外部老的叶梢及叶片后倒置在烧杯中待用。 7.4.2.2 消毒 剪去腋芽苗上部叶片，再用75％的乙醇将腋芽苗表面灭菌处理，然后倒置在干净的烧杯中待用。 7.4.3 茎尖接种 在超净工作台上剪去腋芽苗中上部，留下腋芽苗基部 2 cm～3 cm 的部位，置于 40 倍解剖显微 镜下，用接种针逐层剥去叶梢，直至叶梢剥完，露出茎尖。 7.4.3.2 用解剖刀切取带 1～2 个叶原基，横切面为 1 mm ～3 mm 大的茎尖分生组织。 7.4.3.3 将茎尖分生组织放在无菌水中浸泡 20 min 或者 150 mg/L 的 PVP 溶液中浸泡 15 min。 7.4.3.4 将茎尖接种到 6.1 中 a）的诱导分化培养基中，每个培养容器接种一个茎尖，茎尖直立放置 在滤纸上。 7.4.3.1 2 2 7.4.4 诱导培养 把接种有茎尖的培养瓶，放置于培养室内的光照培养架上做培养。培养过程中应注意避免酚污染对 茎尖的伤害，每天摇晃培养瓶，使茎尖在滤纸上的位置改变，每隔7 d～10 d更换一次诱导培养基，直至 茎尖长出具有4～7个芽的丛生芽苗。 7.4.5 培养环境要求 培养环境要求室内温度保持在28℃±2℃、光照强度1 500 lx～2 500 lx、光照时间每天14 h～16 h。 3 DB45/T 2034—2019 8 脱毒检验 获得的丛生芽苗应进行ScMV、SrMV、RSD病源(毒)检测, 检测方法按NY/T 1804、GB/T 36829的规定 执行，选取检测结果呈阴性的株系作为脱毒组培苗的基础苗。 9 继代增殖培养 在超净工作台上，用长柄枪型镊子将基础苗分成若干丛，每丛3～5株，转移到6.1中 b)的继代增殖 培养基中，每个培养容器放置1～2丛。每隔14 d～20 d 继代培养1次，继代增殖代数6～10代。培养环境 条件同 7.4.5。 10 生根培养 达到预定增殖代数后，将增殖苗转入 6.1 中 c)的生根培养基中进行生根培养，每个生根培养袋转 入 1 瓶增殖苗，然后用封口机将培养袋封口,放置在温室大棚内进行培养 20 d～30 d，待增殖苗的根长 至 2～3 条/株、根系发育健壮时即为生根组培苗，此时可移出培养袋进行假植。 11 假植 11.1 苗床的准备 假植组培苗的苗床应建在有遮光、防虫设施的玻璃温室或塑料薄膜大棚内。假植前 2 d～3 d，将棚 内喷施 2 000 倍的噁霉灵进行消毒。 11.2 洗涤及消毒 将生根组培苗取出，分成若干丛苗，每丛 3～5 株，置于流动清水盆中反复冲洗 2～3 次，沥去多余 水分，用 50％多菌灵可湿性粉剂 800～1 000 倍溶液浸泡 8 min～10 min，置于阴凉处稍微晾干后假植。 11.3 一级苗圃假植 11.3.1 基质的准备 将晒干并粉碎过的黄泥土和干净的河沙按 1:1 的比例混合后，用作组培苗假植的基质。 11.3.2 假植 先将配制好的基质装入规格为6×9孔塑料托盘的盘孔中，再将消毒好的生根组培苗接种入盘孔内， 每个盘孔种植1丛生根组培苗，然后按每3个托盘排成1排、每20～30 排托盘排成1行模式摆放好托盘， 浇足定根水。 11.3.3 盖膜 在摆放托盘处搭建小拱棚,拱棚高80 cm,长、宽根据托盘行的数量而定。小拱棚使用1.0 mm的薄膜进 行覆盖，四周用土压膜密封，膜上盖遮光率70％的遮阳网。 4 DB45/T 2034—2019 11.3.4 水肥管理 后 7 d 内，膜内空气湿度应保持在 80％以上，光照强度应保持在 2 000 lx～15 000 lx。 间 据天气情况，通过适当的浇水及揭盖遮阳网调整膜内的湿度和光照强度。 假植后 7 d～14 d，应早晚揭膜及遮阳网，进行炼苗。 假植 20 d 后，当丛栽苗成活并长出新叶时揭去薄膜和遮阳网，并用 0.4％～0.8％浓度的复 合肥 5:15:15）的水溶液淋施，每周淋施 1～2 次。 11.3.4.1 期 应根 11.3.4.2 11.3.4.3 （1 假植 11.4 二级苗圃假植 11.4.1 分单株假植 丛栽苗在一级苗圃上假植 30 d～50 d 后，当 95％以上的小苗都有独立根系时，把丛栽苗从苗床拔 起 分成单株苗 剪去部分叶片及过长的根，叶片保留 3 cm～4 cm 长，根保留 3 cm～4 cm 长，然后用黄泥 浆浆根后，种植到营养杯（托）中。 , , 11.4.2 水肥管理 后淋足 水 成活前保湿遮荫 土壤湿度保持在 70％～75％。 成活后去 遮阳网 覆盖 ％～ ％浓度的复合肥（15:15:15）的水溶液淋施， 每 淋 ～次 封 后 剪去过长 片 二级 圃上 间 d～ 5 d 待 高长至 30 cm,有