DB50 ICS 11.220 B 43 重 庆 市 地 方 标 准 DB50/T 1006—2020 牛肺炎支原体抗体检测方法 Enzyme-linker immunosorbent assay For Mycoplasma bovis 2020-05-20 发布 2020-08-20 实施 重庆市市场监督管理局 发布 DB50/T 1006—2020 前 言 本标准按GB/T 1.1-2009进行起草。 本标准由重庆市动物疫病预防控制中心提出。 本标准由重庆市农业农村委员会归口。 本标准起草人:蔺露、曾政、姚璐、董春霞、孙燕、谢建华、陈忠琼、凌洪权、梁望旺、杨泽林、 程千川。 DB50/T 1006—2020 牛肺炎支原体抗体检测方法 1 范围 本标准规定了牛肺炎支原体抗体检测方法，利用牛肺炎支原体抗体酶联免疫吸附试验，检测牛肺炎 支原体抗体。 本方法适用于检测牛血清（血浆）的牛肺炎支原体抗体。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 牛肺炎支原体 是指引起牛传染性支原体肺炎（又称烂肺病）以肺部病变为主要特征的传染病的一种支原体。 3.2 酶联免疫吸附试验 简称酶联免疫法，或者ELISA法。将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表 面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，抗体与酶复合物结 合，然后通过显色来检测。 4 牛肺炎支原体 P39 抗原酶联免疫吸附试验 4.1 试验材料 洗液：配制见附录第A.1章；稀释液：配制见附录第A.2章；标准阳性血清：含牛肺炎支原体抗体的 牛血清；标准阴性血清：无牛肺炎支原体抗体的牛血清；酶结合物：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊 抗牛IgG；底物溶液：配制参见附录第A.3-A.4章；终止液：配制参见附录第A.5章。 4.2 操作步骤 4.2.1 样品准备 将被检血清（或血浆）用稀释液（见附录A.2）做1:40稀释。 4.2.2 加样 取出抗原包被板，A1、B1加入100μL阴性对照，C1、D1加入100μL阳性对照，其余孔加入1:40稀释 的被检血清（血浆），每孔100μL，将加样位置做好记录，用封膜封板，室温孵育30min。 4.2.3 洗涤 1 DB50/T 1006—2020 吸除孔内液体，每孔加300μL冲洗液（见附录A.1）冲洗，重复5次，在吸水纸上轻拍，确保孔内无 残留液体。 4.2.4 加酶标抗体 每孔加入酶标抗体液100μL，以封膜封板，室温孵育30min。 4.2.5 洗涤 洗涤方法同4.2.3。 4.2.6 加底物 每孔加入100μL底物使用液（见附录A.3和附录A.4），室温孵育10min。 4.2.7 终止 加终止液（见附录A.5），100μL/孔，使其终止反应。 4.3 结果判定 设定酶标仪检定波长在450nm（即OD值）；阳性对照均值（PC）＞0.5，阳性对照OD值的均值（PC） 与阴性对照均值（NC）的比值＞4，判定实验有效，若两者不成立，则实验无效，需重复；待测样本的 判定，S/P值≥0.4者判定为阳性，S/P值＜0.4为阴性样本。 S/P= 其中S为待测样本的OD值。 2 S  NC PC  NC DB50/T 1006—2020 附录 A 试剂的配制 A.1 磷酸盐缓冲液（含 0.05%Tween-20 的 0.01mol/L pH7.4 的 PBS，即 PBST） PBS 氯化钠 8g 磷酸二氢钠 0.2g 磷酸氢二钠 2.9g 氯化钾 0.2g 蒸馏水 加至 1000mL PBST Tweent-20 0.5mL 加 0.01mol/L pH7.4 的 PBS 至 100mL A.2 稀释液（含 0.1%BSA 的 PBST） 牛血清白蛋白(BSA) 0.1g 加 PBST 至 100mL 4℃存放，避光。 A.3 底物缓冲液 柠檬酸 0.47g 十二水合磷酸氢二钠 1.84g 蒸馏水 加至 100mL，pH 值 5.0-5.4 A.4 底物使用液 TMB(2mg/mL ) 0.5mL 底物缓冲液（pH5.5） 9.5mL 0.75%H2O2 42μL A.5 终止液 浓硫酸 11.1mL 蒸馏水 88.9mL 3