(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210562300.3 (22)申请日 2022.05.23 (71)申请人 立凌生物制药 （苏州） 有限公司 地址 215000 江苏省苏州市苏州工业园区 顺达商业广场1幢5 02室 (72)发明人 王文博　冯爱华　王鹏　 (74)专利代理 机构 北京象合知识产权代理事务 所(普通合伙) 11893 专利代理师 封明艳 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) A61K 35/17(2015.01) A61K 45/06(2006.01)A61P 35/00(2006.01) A61P 37/02(2006.01) A61P 31/00(2006.01) (54)发明名称 一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应 用 (57)摘要 本发明涉及医药技术领域， 具体涉及一种快 速克隆配对TCR序列检测方法及其应用。 所述的 方法包括以下步骤： 肿瘤组织中分选并捕获单个 肿瘤反应性T细胞， 提取、 标记单个细胞的mRNA， 反转录并构建全长cDNA， cDNA特异性PCR扩增得 到cDNA全长转录组； cDNA全长转录组富集后， 与 启动子序列连接、 环化并进行TCR序列的特异性 扩增， 扩增产物富集后连接到表达载体中得到 TCR的全长克隆， 进行文库序列比对获得配对的 TCR序列。 本发明的优点： 在一个 反转录体系内实 现数百个细胞的配对TCR克隆， 实现快速， 低成 本， 并且高通 量的获取配对 TCR。 权利要求书3页 说明书19页 序列表1页 附图3页 CN 115029341 A 2022.09.09 CN 115029341 A 1.一种快速克隆配对TCR序列的方法， 所述的方法包括以下步骤： 肿瘤组织中分选并捕 获单个肿瘤反应性T细胞， 提取、 标记单个细胞的mRNA， 反转录并构建全长cDNA， cDNA特异性 PCR扩增得到 cDNA全长转录组； 其特征在于： cDNA全长转录组富集后， 与启动 子序列连接环化并进行TCR序列的特异性 扩增， 扩增产 物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆， 进 行文库序列比对获得配对 的TCR序列。 2.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于： 所述的方法 中， mRNA反转录时在反转录体系中加入TSO， 扩增完成cDNA全长转录组的富 集。 3.根据权利要求2所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于： 所述的方法 中， 通过单细胞标记磁珠5 ’端的恒定区序列及反转录过程中添加上的TSO序列， 扩增完成全 长转录组的富 集。 4.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于， 所述的方法 中环化方法为： 环化时直接将启动子序列插入到TSO序列之前； 所述的启动子是任一启动mRNA转录的 基因元件， 包括但不限于 CMV、 EF1alpha、 SV40、 PGK1、 CAG、 T7、 Sp6； 设计PCR引物扩增CMV启动子序列CMV ‑P， 并在正向和反向引物的5 ’端添加cDNA同源序 列后进行TCR序列的特异性扩增， 完成TCR的扩增； CMV启动子序列C MV‑P的核酸序列如Seq  ID No.1所示。 5.根据权利 要求4所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于： 所述的PCR引 物包括CMV‑P‑F和CMV‑P‑F； CMV‑P‑F序列： AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAG GGGCATTGATTATTGACTAGT TAT； CMV‑P‑F序列： CCCCAAGTACTCTGCGT TGATACCAACCTCTGCTTATATAGAC CTCC。 6.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于： 所述的配对 TCR序列包 含TCR‑alpha和TCR ‑beta系列。 7.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于： 所述的表达 载体为任一具有复制子和抗性基因元件的质粒； 优选的表达载体为线性化pMax ‑TRAC和 pMax‑TRBC载体； 表达载体pMax经过人工改造去掉载体自身的CMV启动子， 添加TCR  alpha恒定区得到 pMax‑TRAC， 添加TCR  beta恒定区得到pMax ‑TRBC； 通过重组的方法将 纯化后的TCR  alpha‑1克隆到pMax ‑TRAC， 将纯化后的TCR  beta‑1克 隆到pMax ‑TRBC后具有完整的TCR表达 框。 8.根据权利要求1所述的一种快速快速克隆配对TCR序列的方法， 其特征在于， 分选单 个肿瘤反应性T细胞 的方法为： 肿瘤组织消 化为单细胞并制备成单细胞悬液后注入微流控 芯片获得 单个肿瘤反应性T细胞。 9.一种TCR ‑T细胞， 其特征在于： 所述TCR ‑T细胞是通过生物工程技术将权利要求1～8 任意一项获得的配对TCR序列注入相应的T细胞后获得。 10.根据权利要求9所述的一种TCR ‑T细胞， 其特征在于： 所述相应的T细胞是指个体自权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115029341 A 2身T细胞或异源T细胞。 11.一种药物 组合物， 其特征在于： 所述药物 组合物中含有权利要9或10所述的TCR ‑T细 胞。 12.根据权利要求10所述的药物组合物用于治疗与T细胞相关的疾病， 所述疾病 包括感 染性疾病 、 肿瘤、 自身免疫疾病和器官移植。 13.一种诊断和/或评估制剂， 所述诊断和/或评估制剂中含有权利要求9或10所述的 TCR‑T细胞。 14.根据权利要求12所述的诊断和/或评估制剂， 其特征在于： 所述的制剂制备为制剂 盒。 15.根据权利要求13或14所述的诊断和/或评估制 剂用于制备诊断或评估与T细胞相关 的疾病或事 件的试剂盒的用途； 所述疾病或事 件包括感染性疾病 、 肿瘤、 自身免疫疾病和器官移植。 16.根据权利要求11或12所述的药物组合物用于制备治疗与T细胞相关的疾病的药物 的用途， 所述疾病包括癌症、 感染性疾病和自身免疫病。 17.根据权利要求16所述的药物组合物的用途， 其特征在于： 所述的癌症选自由急性淋 巴细胞白血病、 急性髓性白血病、 肾上腺皮质癌、 AIDS相关癌症、 AIDS相关淋巴瘤、 肛门癌、 阑尾癌、 星形细胞瘤、 神经母细胞瘤、 基底细胞癌、 胆管癌、 膀胱癌、 骨癌、 脑肿瘤、 乳腺癌、 支 气管腺瘤、 伯基特淋巴瘤、 原发性未知癌、 中枢神经系统淋巴瘤、 小脑星形细胞瘤、 宫颈癌、 儿童癌症、 慢性淋巴细胞白血病、 慢性骨髓性白血病、 慢性骨髓增生性疾病、 结肠癌、 皮肤T 细胞淋巴瘤、 结缔组织增生性小 圆细胞瘤、 子宫内膜癌、 室管膜瘤、 食道癌、 尤因氏肉瘤、 生 殖细胞肿瘤、 胆囊癌、 胃癌、 胃肠道类癌肿瘤、 胃肠道间质瘤、 胶质瘤、 毛细胞白血病、 头颈 癌、 心脏癌、 肝细胞癌、 霍奇金淋巴瘤、 咽下癌、 眼内黑色素瘤、 胰岛细胞癌、 卡波西肉瘤、 肾 癌、 喉癌、 唇癌和口腔癌、 脂肪肉瘤、 肝癌、 肺癌、 淋巴瘤、 白血病、 巨球蛋白血症、 骨恶性纤维 组织细胞瘤/骨肉瘤、 成神经管细胞瘤、 黑色素瘤、 间皮瘤、 原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、 口腔癌、 多发性内分泌肿瘤综合症、 骨髓增生异常综合症、 骨髓性白血病、 鼻腔和 副鼻窦癌、 鼻咽癌、 神经母细胞瘤、 非霍奇金淋巴瘤、 非小细胞肺癌、 口腔癌、 口咽癌、 骨肉瘤/骨 恶性纤 维组织细胞瘤、 卵巢癌、 卵巢上皮癌、 卵巢生殖细胞肿瘤、 胰腺癌、 胰腺癌胰岛细胞、 副鼻窦 和鼻腔癌、 甲状旁腺癌、 阴茎癌、 咽癌、 嗜铬细胞瘤、 松 果体星形细胞瘤、 松 果体生殖细胞瘤、 垂体腺瘤、 胸膜肺母细胞瘤、 浆细胞瘤、 原发性中枢神经系统淋巴瘤、 前列腺癌、 直肠癌、 肾 细胞癌、 肾盂和输尿管移行细胞癌、 视网膜母细胞瘤、 横纹肌肉瘤、 唾液腺癌、 肉瘤、 皮肤癌、 默克尔细胞皮肤癌、 小肠癌、 软 组织肉瘤、 鳞状细胞癌、 胃癌、 T细胞淋巴瘤、 咽喉癌、 胸腺瘤、 胸腺癌、 甲状腺癌、 滋养细胞肿瘤、 原发部位未知癌、 尿道癌、 子宫肉瘤、 阴道癌、 外阴癌、 瓦 尔登斯特伦巨球蛋白血症和 威尔姆斯瘤组成的组， 所述的自体免疫性疾病选自由关节炎、 慢性阻塞性肺疾病、 强直性脊柱炎、 克罗恩病、 皮肌炎、 I型糖尿病、 子宫内膜异位症、 Goodpasture氏综合症、 Graves氏病、 格林 ‑巴厘综合症、 桥本氏病、 化脓性汗腺炎、 川崎病、 IgA肾病、 原发性血小板减少性紫癜、 间质性膀胱炎、 红斑狼疮、 混合性结缔 组织病、 硬斑病、 重症肌无力、 嗜睡症、 神经性肌强直、 寻常型天疱疮、 恶性贫血、 银屑病、 银屑病关节炎、 多发 性肌炎、 原发性胆汁性肝硬化、 复发性多软骨炎、 类风湿关节炎、 精神分裂症、 硬皮病、 干燥 综合症、 僵人综合症、 颞动脉炎、 溃疡性结肠炎、 脉管炎、 白斑病以及韦格纳肉芽肿组成的权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 115029341 A 3