(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210350074.2 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 求臻医学科技 （北京） 有限公司 地址 100000 北京市大兴区北京经济技 术 开发区经海四路15 6号3号楼1层101 (72)发明人 刘金超　王天阳　牛孝亮　段小红　 (74)专利代理 机构 重庆百润洪知识产权代理有 限公司 5 0219 专利代理师 陈付玉 (51)Int.Cl. C12Q 1/6876(2018.01) C12Q 1/6806(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 增强荧光 强度的扩增引物、 分子量内标及制 备方法 (57)摘要 本发明涉及生物 技术领域， 特别涉及增强荧 光强度的扩增引物、 分子量内标及制备方法。 与 现有技术相比， 本发明通过荧光共振能量转移技 术， 将具有两种不同激发波长荧光基团标记的扩 增引物与位于pUC5 7质粒上特定长度的核 酸片段 反应制得分布均匀的分子量内标， 可以高效的将 加入的扩增引物完全消耗， 适用于毛细管电泳 仪， 荧光信号比普通的分子量内标高10倍以上， 大大降低了分子量内标的使用成本 。 权利要求书3页 说明书8页 序列表17页 附图1页 CN 115074428 A 2022.09.20 CN 115074428 A 1.增强荧 光强度的扩增引物， 其特 征在于： 包括 正向引物和反向引物； 所述正向引物序列为 GP‑F： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTC 所述反向引物序列为 GP‑R:CCAAGATGACCAACAGAGCGAG； 所述GP‑F引物的碱基上分别修饰受体荧光基团和供体荧光基团， 供体荧光基团的激发 波长小于受体荧 光基团的激发波长 。 2.根据权利要求1所述的增强荧光强度的扩增引物， 其特征在于： 所述受体荧光基团和 所述供体荧光基团均标记在所述GP ‑F引物5’端的碱基上， 并且所述受体荧光基团和所述供 体荧光基团相距至少一个碱基。 3.根据权利要求2所述的增强荧光强度的扩增引物， 其特征在于： 所述受体荧光基团修 饰所述GP ‑F引物5’端的第2个T碱基， 所述供体荧光基团修饰所述GP ‑F引物5’端的第4个T碱 基。 4.根据权利要求2所述的增强荧光强度的扩增引物， 其特征在于： 所述供体荧光基团为 FAM、 HEX、 TET、 VIC、 C Y3； 所述受体荧 光基团为C Y5。 5.增强荧 光的分子量内标的制备 方法， 其特 征在于包括以下步骤： S1.分别以合成质粒作 为模板、 权利 要求1‑4所述的扩增引物、 聚合酶配置成扩增体系， 进行多重PCR扩增； S2.检测各PCR扩增产物检测并混合； S3将混合产物纯化， 得到分子量内标。 6.根据权利要求5所述的增强荧光的分子量内标的制备方法， 其特征在于所述合成质 粒分别为： L75： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGTTGGT CATCTTGG； L90： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAACCAGAGCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTAC ACCACACTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L150： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTAATTCCCAGTTGAGTCTGTGGCTTCTCGGATCCCAGA GCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L180： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTCGGCTTGAAGATCGTCAGTCCTTTCGTAACAATTCCC AGTTGAGTCTGTGGCTTCTCGGATCCCA GAGCCAGAAGGAATCAACAACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L210‑120： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCAACAGCTATGACCTCGGCTTGAAGTTGCATCCGGATGTTAGAACTGAATGT GAGATCGTCA GTCCTTTCGTAACAATTCCCA GTTGAGTCTGTGGCTTCTCGGATCCCA GAGCCAGAAGGAATCAAC AACATGCCCTTTACACCACACTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG；权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 115074428 A 2L235： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCCGCCCAAGTATCCCTGTAAAACAAAAACCAAAAGAAAAGGATTTGGAGTTC CATGGAGTGATGAGATTTTATTTTCAA GATAAAGCTGCTGGAAACTTTGCAACAAAATGTATTCGGGTCTCTA GTA CTGCCACCACTCAA GATGTAATCGAAACGCTCGCGGA GAAATTTCGACCTGATATGCGAACTCGCTCTGTTGGTCA TCTTGG； L265： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCTGAACCTTTAATTAAAAAGTTGAAGAAACCCCCTACAGATGAAGAGTTAAA GGAAACAATAAA GAAATTACTGGCCA GTGCTAACTTGGAA GAAGTCACAATGAAACAGATTTGCAAAAA GGAAATT CGGCGCCTTCATCA GTATGTGAAATTTGCTGTCCAA GATGTGAATGATGTTCTA GACTTGGA GTGGGATCA GCATC TGGAACAAAAGAAACTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L305： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCGAGTAGCTATGGTCAACAAAGCAGCTATGGGCAGCAGCCTCCCACTAGTTA CCCACCCCAAACTGGATCCTACA GCCAAGCTCCAAGTCAATATAGCCAACAGA GCAGCAGCTACGGGCA GCAGATT GCCATTGCCCCAAATGGA GCCTTACA GTTGGCAA GTCCAGGCACAGATGGAGTACA GGGACTTCA GACATTAACCA TGACAAATTCAGGCAGTACTCAGCA AGGTACAACTATTCTTCAGCTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L335： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCACAGCTATGGACAGCAGAGTAGCTATGGTCAACAAAGCAGCTATGGGCAGC AGCCTCCCACTA GTTACCCACCCCAAACTGGATCCTACA GCCAAGCTCCAAGTCAATATA GCCAACAGAGCAGCAG CTACGGGCA GCAGAACCCTTCTTATGACTCA GTCAGAAGAGGAGCTTGGGGCAATAACATGAATTCTGGCCTCAAC AAAAGTCCTCCCCTTGGA GGGGCACAAACGATCA GTAAGAATACA GAGCAACGGCCCCA GCCAGATCCGTATCACT CGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L365： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCTTTGAACTTGCTCCCTCAGGCTACTCAGCAGCCTCAGGAAGGTTGTAGGGA TTAGAGAGGGAGTGAAGTGAATGTTGCTGA GGTTTTCCA GCACTCTGACATATGGCCATTTCTGTTTTCCTGTA GC AAAACCAGAAATCCTGACTTACGGCA GGCTCGTGAATGGCATGCTCCAATGTGTGGCA GCAGGATTCCCAGA GCCC ACAATAGATTGGTATTTTTGTCCA GGAACTGAGCA GAGGTGAGATGATTATTTTTGGCACTGCTTATAATGCA GAG GGGAAGGACTGCAATTCACTTGAATTTCAAATACTCGCTCTGT TGGTCATCTTGG； L390： GTCTTCGGGTGGCTTTGTGTCTCTGTTTCTCCCTCTGCAGAGTTGTTAGCGGTTCTCAAGATGCCACTCTTA GGGTTTGGGATATTGA GACAGGCCAGTGTTTACATGTTTTGATGGGTCATGTTGCA GCAGTCCGCTGTGTTCAATA TGATGGCA GGAGGGTTGTTA GTGGAGCATATGATTTTATGGTAAA GGTGTGGGATCCA GAGACTGAAACCTGTCTA CACACGTTGCA GGGGCATACTAATAGA GTCTATTCATTACA GGTAAGATCTCTTATCTCTCCCTTAAATGCTCTCC TGATGAATCATAAGGTTGTTTTACTCA GATAATCACTGTCAAATTGCTGATCCA GTACAGTCCAAAAACTCGCTCT GTTGGTCATCTTGG； L425 GTCTTCGGGT