(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210345207.7 (22)申请日 2022.04.02 (71)申请人 江苏农林职业 技术学院 地址 212400 江苏省镇江市句容市文昌东 路19号 申请人 北京林业大 学　 南京海关动植物与食品检测中心 (72)发明人 陈佳佳　戴玉成　员瑗　刘晓宇　 于健　吴慕桥　周洪敏　吴翠萍　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 傅婷婷 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物 组合物、 试剂盒及其检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测南洋杉异担子 菌的LAMP引物组合物、 试剂盒及其检测方法。 用 于检测南洋杉异担子菌的引物组合物是由正向 内引物FIP、 反向内引物BIP、 正向外引物F3、 反向 外引物B3和环引物LF组成。 本发明根据南洋杉异 担子菌的RNA聚合酶II第二大亚基RPB2序列设计 引物， 反应程序为： 63℃等温条件扩增60min， 能 快速、 方便、 高效、 高特异、 高灵敏地检测到待检 样品中存在的南洋杉异担子菌， 不需要复杂仪 器， 能较好满足对南洋杉异担子菌的现场检测， 适用于出入境植物和植物的检验检疫和病害的 调查、 快速诊断及监测等， 对防止南洋杉异担子 菌传入我国具有重要意义， 同时， 本发明体系的 建立也为其他病原菌的检测提供了技术指导和 理论依据。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图3页 CN 115094154 A 2022.09.23 CN 115094154 A 1.一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物， 其特征在于， 该引物组合物由以 下引物组成:如SEQ  ID No.1所示的正向内引物FIP， 如SEQ  ID No.2所示的反向内引物BIP， 如SEQ ID No.3所示的正向外引物F3， 如SEQ  ID No.4所示的反向外引物B3， 如SEQ  ID No.5 所示的正向环引物LF。 2.权利要求1所述的LAMP引物组合物在检测南洋杉异担子菌中的应用， 所述的检测为 非疾病诊断目的 的检测。 3.权利要求1所述的LAMP引物 组合物在制备用于检测南洋杉异担子菌的试剂 盒中的应 用。 4.一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP试剂盒， 其特征在于， 该试剂盒中包含权利要 求1所述的LAMP引物组合物。 5.根据权利要求4所述的用于检测南洋杉异担子菌的LAMP试剂盒， 其特征在于， 所述的 试剂盒还包含10 ×ThermoPol  Buffer、 MgS 04、 dNTPs、 甜菜碱， Bst  DNA polymerase、 羟基萘 酚蓝。 6.权利要求4或5所述的LAMP试剂盒在检测南洋杉异担子菌中的应用， 所述的检测为非 疾病诊断目的 的检测。 7.一种南洋杉异担子菌的LAMP检测方法， 其特征在于提取待检微生物DNA， 取DNA溶液 作为反应模板， 以权利要求1所述的引物组合物进行LAMP反应， 然后观 察扩增产 物的颜色变 化， 若呈天蓝色表示检测结果为阳性， 存在南洋杉异担子菌， 若呈紫色表示检测结果为阴 性， 不存在南洋杉异担 子菌。 8.根据权利要求7所述的LAMP检测方法， 其特征在于LAMP反应体系为:2.5μL  10× ThermoPol  Buffer， 8mmol ·L‑1MgS04， 1.2mmol·L‑1dNTPs， 内引物FIP和BIP各1.6 μmol ·L ‑1， 外引物F3和B3各0.4μmol ·L‑1， 0.8μmol ·L‑1环引物LF， 0.8μmol ·L‑1甜菜碱， 8U ·μL‑ 1Bst DNA polymerase， 180m mol·L‑1羟基萘酚蓝， 2 μL模板DNA， 灭菌水补至26 μL。 9.根据权利要求7或8所述的LAMP检测方法， 其特征在于所述LAMP反应的程序为： 63℃ 反应扩增6 0min。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115094154 A 2一种用于 检测南洋杉异 担子菌的LAMP引物组合物、 试剂盒及 其检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及一种用于检测南洋杉异担子菌的LAMP引物组合物 及其应用。 背景技术 [0002]南洋杉异担子菌(Heter obasidion  araucariae)属于担子菌门(Basidiomycota)， 伞菌纲 (Agarico mycetes)， 红菇目(Russu lales)， 刺孢多 孔菌科(Bondar zewiaceae)， 异担 子菌属(Heterobasidion)。 异担子菌属中许多种是引起针叶树干基腐朽病的病原菌， 引起 的病害对许多针叶树造成树木 干基白色腐朽病害， 直接 造成森林的大面积死 亡。 [0003]目前， 针对南洋杉异担子菌 的检测技术较少。 传统的检测方法主要是应用平板分 离法， 依据南洋杉异担子菌的形态学进 行鉴定。 该方法耗时耗力， 需要丰富和专 业的菌物 鉴 定经验， 而且很难依据形态学特征将南洋杉异担子菌与相 近种区分开， 无法满足林间生产 上的需求。 随着分子生物学的发展， 特别PCR技术的普及， 越来越多的分子生物学技术被应 用到南洋杉异担子菌的检测中。 但是这些检测 技术往往需要在具有专业仪器、 试剂和严格 环境条件的实验室中进 行， 仪器和试剂的价格昂贵且操作要求较高， 过程复杂， 检测时间仍 然较长， 不能满足快速检测的需求， 不 适宜在基层环境中使用推广。 [0004]环介导等 温扩增技术(Loop ‑mediated  isothermal  amplification， LAMP)是近些 年开发的一种新的核酸扩增技术， 因为其操作简单、 快速、 特异 性高、 成本低等优点， 成为可 以替代普通  PCR的新的核酸扩增技术。 它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物， 在 Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应， 60～65℃范围60min内， 大量合成目标 DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷酸镁沉淀产生。 在反应体系中加入SYBR  Green、 羟基 萘酚蓝(HNB)  等显色染料， 可通过肉眼观察颜色变化来判定。 由于LAMP扩增过程依赖识别 靶序列6个独立区域， 所以反应特异性很强， 并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行， 普通 水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求， 检测成本大大降低。 目前此技术已广泛 应用于真菌、 细菌、 病毒和卵菌的快速检测， 但在南洋杉异担子菌的检测国内外均未见报 道。 [0005]戴玉成等曾报道了 RNA聚合酶II大亚基序列(RPB1)分子标记在异担子菌种类中敏 感性最高， 是通过基因手段鉴别不同异担子菌种类的可信片段， 并以此为靶标设计引物用 于异担子菌的分子鉴定。 然而在实际应用中， 异担子菌的RPB1序列的扩增反应常常不易成 功， 致使无法成功且快速进行分子鉴定 。 发明内容 [0006]本发明的目的是针对现有技术中南洋杉异担子菌的生物学检测方法所需周期长、 费时费力、 繁琐、 特异性差的问题及PCR检测技术需要热循环仪器， 无法快速检测南洋杉异 担子菌的问题， 而提供了一种快速检测南洋杉异担子菌的LAMP检测引物组合物及其分子检说　明　书 1/5 页 3 CN 115094154 A 3