(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210353782.1 (22)申请日 2022.04.06 (71)申请人 南京师范大学 地址 210024 江苏省南京市 鼓楼区宁海路 122号 (72)发明人 王敏　臧雪纯　廖书嘉　傅智能　 王涛　尹绍武　 (74)专利代理 机构 南京苏高专利商标事务所 (普通合伙) 32204 专利代理师 柏尚春 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试 剂盒及鉴定方法 (57)摘要 本发明提供一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体 耐低氧能力试剂盒及鉴定方法， 涉及水产生物技 术领域， 本发 明所述鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧 能力的试剂盒， 包括两个基因的特异性正向引物 和特异性反向引物， 其引物序列分别如SEQ  ID  NO.1、 SEQ  ID NO.2、 SEQ  ID NO.3、 SEQ  ID NO.4 所示。 采用本发明的研究方法， 瓦氏黄颡鱼在低 氧胁迫12小时后， 通过测定肝脏组织两个基因的 相对表达量， 划定其相对表达量的区间， 判断待 测群体的耐低氧能力。 本发明为初步筛选瓦氏黄 颡鱼耐低氧群 体提供方法。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114752679 A 2022.07.15 CN 114752679 A 1.一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒， 其特征在于， 包括catalase、 trypsin特异性正向引物和特异性反向引物； 所述catalase特异正向引物的核苷酸序列如 SEQ ID NO.1GTGAGCGCATTCCTGAACGG所示， 特异反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2AGAGAACCTCACAGCGACCG所示； 所述trypsin特异正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3GATCAAGCGAAGGACTTTGTGAAGAAC所示， 特异反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4AGGATGAGGATGGAGGCAGAACC所示。 2.根据权利要求1所述的快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂 盒， 其特征在于， 所述试剂盒还 包括qRT‑PCR反应缓冲液和蒸馏水。 3.根据权利要求2所述的快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂 盒， 其特征在于， 所述qRT‑PCR反应缓冲液为2 ×Taq Pro Universal SYBR Green qPCR Master Mix。 4.一种权利要求1所述试剂盒的鉴定方法， 其特 征在于， 包括如下步骤： (1)提取待测瓦氏黄颡鱼肝脏样品的RNA， 反转录， 得到 cDNA； (2)以步骤(1)所得cDNA为模板， 利用所述试剂盒进行qRT ‑PCR反应， 计算得到 catalase、 trypsin的相对表达量， 通过catalase相对表达量是否在1.5 ‑2.5和trypsin相对 表达量是否在0.2 ‑0.6判断待测瓦氏黄颡鱼样品的耐低氧能力。 5.根据权利要求4所述试剂盒的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述提取方法包括 硅胶膜纯化 技术。 6.根据权利要求4所述试剂盒的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述qRT ‑PCR反应 体系， 每20 ‑50 μL包括： cDNA模板2 ‑5 μL、 特异性正向引物0.4 ‑1 μL、 特异性反向引物0.4 ‑1 μL、 qRT‑PCR反应缓冲液10 ‑25 μL和蒸馏水 7.2‑18 μL。 7.根据权利要求4所述试剂盒的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述qRT ‑PCR反应 体系的反应程序为： 95℃30s， 然后扩增40个循环， 每个循环反应程序为95℃10s， 60℃30s， 最后熔解， 程序为95℃15s,6 0℃60s,95℃15s。 8.根据权利要求4所述试剂盒的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述判断方法为当 至少满足一个区间时， 说明该群体耐低氧能力一般； 当catalase和trypsin相对表达量都在 0.9‑1.1时， 说明该群 体耐低氧能力好； 若两个都不满足说明该群 体耐低氧能力差 。 9.根据权利要求4所述试剂盒的鉴定方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述瓦氏黄颡鱼肝 脏样品为鱼体长12 ‑14cm， 体重1 1‑20g的瓦氏黄颡鱼低氧处 理12小时的肝脏组织。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752679 A 2快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒及鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明涉及水产生物技术领域， 尤其涉及 一种快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能 力试剂盒及鉴定方法。 背景技术 [0002]自然状况下， 由于水体盐度的变化、 水生植物的光合作用、 水面风速大小、 温度的 升降、 昼夜变化和季节变换等， 水体中的溶解氧浓度会随之发生变化。 加上人类的活动， 农 业生产中大量的施用化肥造成的水体富营养化、 生活和工业污水的排放和全球变暖等现 象， 养殖鱼类的低氧耐受 能力大大限制了水产养殖密度， 因此， 对养殖鱼类群体耐低氧能力 进行判断并在幼苗时期就筛 选具有耐低氧能力群 体对于养殖产业的发展至关重要。 [0003]瓦氏黄颡鱼(Pelteobagrus  vachelli)俗称江黄颡鱼、 硬角黄蜡丁、 朗丝(四川)、 肥佗、 黄姑， 主要分布于长江、 珠江、 钱塘江、 淮河、 黄河及其支 流。 瓦氏黄颡鱼具有生长速度 快、 食性杂、 容易驯养、 营养价值高、 肉味鲜美等优点， 因此是水产养殖业一个很有养殖前景 的品种。 但是在低氧下， 瓦氏黄颡鱼的食欲下降， 使 得鱼体生长缓慢， 肥满度降低。 为了避免 鱼体质量下降， 需要花费大量成本来 维持水体适宜的溶氧浓度， 避免浮头甚至泛塘的出现。 根据本实验室之前所授权的专利 “一种鉴定瓦氏黄颡鱼低溶氧耐受性和肥满度的SNP分子 标记及其应用 ”(ZL 201811294276.X)， 与其区别特征在于， 本专利取瓦氏黄颡鱼肝脏组织 利用特异性引物对catalase和trypsin进行qRT ‑PCR实验， 通过计算其相对表达量， 判断所 测鱼体耐低氧程度。 本专利适用于瓦氏黄颡鱼耐低氧群 体的初步筛 选。 发明内容 [0004]发明目的： 为了解决鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的问题， 本发明提供了一种 快速鉴定瓦氏黄颡鱼群 体耐低氧能力的试剂盒及其 鉴定方法。 [0005]技术方案： 本发明的快速鉴定瓦氏黄颡鱼群体耐低氧能力的试剂盒， 包括 catalase、 trypsin特异性正向引物和特异性反向引物； 所述catalase特异正向引物的核苷 酸序列如SEQ  ID NO.1GTGAGCGCATTCCTGAACGG所示， 特异反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.2AGAGAACCTCACAGCGACCG所示； 所述trypsin特异正向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.3GATCAAGCGAAGGACTTTGTGAAGAAC所示， 特异反向引物的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.4AGGATGAGGATGGAGGCAGAACC所示。 [0006]进一步地， 所述试剂盒还 包括qRT‑PCR反应缓冲液和蒸馏水。 [0007]进一步地， 所述qRT ‑PCR反应缓冲液为2 ×Taq Pro Universal  SYBR Green qPCR  Master Mix。 [0008]本发明还公开 一种所述试剂盒的鉴定方法， 包括如下步骤： [0009](1)提取待测瓦氏黄颡鱼肝脏样品的RNA， 反转录， 得到 cDNA； [0010](2)以步骤(1)所得cDNA为模板， 利用所述试剂盒进行qRT ‑PCR反应， 计算得到 catalase、 trypsin的相对表达量， 通过catalase相对表达量是否在1.5 ‑2.5和trypsin相对说　明　书 1/5 页 3 CN 114752679 A 3