(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210375800.6 (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 广西壮族自治区农业科 学院 地址 530007 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘区大学东路174 号 (72)发明人 杨行海　张宗琼　夏秀忠　农保选　 李丹婷　曾宇　吴艳艳　荘洁　 蓝远芬　 (74)专利代理 机构 广西中知科创知识产权代理 有限公司 4513 0 专利代理师 汤凌志 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 1/04(2006.01)G16B 20/20(2019.01) G16B 20/50(2019.01) (54)发明名称 一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的 功能分子标记与应用 (57)摘要 本发明涉及分子标记 技术领域， 本发 明公开 了一种与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功 能分子标记及其应用， 该标记位于 水稻OsNPF3.1 基因第6号染色体的第8741040核 酸位点， 该位点 的碱基为G或A， 对应位于核酸序列表SEQ  ID  NO.1的第51位核酸位点。 且公开了 该分子标记在 选育或辅助选育与水稻氮素利用效率相关的水 稻品种或 品系的用途， 具体是选育或辅助选育水 稻氮肥利用率高/低的水稻中的应用。 通过验证 研究发现 OsNPF3.1Chr6 _8741040检测结果可靠性高。 权利要求书2页 说明书5页 序列表2页 附图1页 CN 114561488 A 2022.05.31 CN 114561488 A 1.与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记， 其特征在于： 所述与水稻氮肥 利用效率基因O sNPF3.1的功能分子标记如下： 标记为： 位于水稻第6号染色体的第8741040核酸位点， 该位点的碱基为G或A， 对应位于 核酸序列表SEQ  ID NO.1的第51位核酸 位点。 2.一种应用权利要求1所述的与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记在选 育或辅助选育与水稻 氮素利用效率相关的水稻品种或品系的用途， 具体是选育或辅助选育 水稻氮肥利用率高/低的水稻。 3.一种应用权利要求1所述的与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记选育 或辅助选育与水稻 氮素利用效率相关的水稻品种或品系的方法， 其特征在于： 具体步骤为： 提取水稻基因组DNA， 检测水稻的第6号染色体的第8741040位核苷酸， 检测出第8741040位 核苷酸的序列为G或A， 确定待测水稻的基因型是AA、 AG或GG型， 根据需要选择AA型基因的水 稻进行下一步选种和/或育种。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述AA型基因的水稻氮素利用效率高于AG 或GG型基因水稻。 5.根据权利要求1所述的与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记， 其特征 在于， 所述水稻氮素利用效率的相关候选基因为O sNPF3.1基因。 6.一种鉴定如权利要求1所述与水稻氮肥利用效率基因OsNPF3.1的功能分子标记的方 法， 其特征在于： 具体步骤为： (1)水稻氮肥利用效率 的表型鉴定： 在0.5和1.5mM  NH4NO3水稻营养液中鉴定132份籼 稻和22份粳稻的氮肥利用效率， 主 要考查株高和干物质重量； (2)OsNPF3.1基因组区域变异位点分析： 利用3K数据库中的Rice  SNP‑Seek Database 下载OsNPF3.1基因 组区域变异位 点， 共有31个SNPs； (3)154份材料的基因分析： 依据31个位点序列信息， 设计了25对引物。 采用PARMS技术 对132份籼稻和2 2份粳稻进行基因分型， 18个位 点可以正常 分析； (4)关联分析： 将154个水稻品种的基因型与表型进行关联分析， 在GLM模型下有两个变 异位点与氮素利用效率相关， 分别为OsNPF3.1Chr6_8741040和OsNPF3.1Chr6_8742153； 水稻日本 晴基因组在OsNPF3.1Chr6 ‑8741040的基因型为GG， GG基因型有22个水稻品种， AA基因型有130 个， 其中GG为氮素不敏感优异等位变异； 日本晴基因组在OsNPF3.1Chr6_8742153的基因型为 TT， TT基因有8个， G G基因型有146个， 其中T T为氮素不敏感优异等 位变异； (5)OsNPF3.1Chr6_8741040引物信息： 根据水稻第6染色体第8741040处位点G →A突变， 设 计了PARMS分子标记OsNPF3.1Chr6_8741040， 该标记由3条OsNPF3.1基因的特异引物构成， 在 设计的正向引物中引入两个碱基的差异： 正向引物 OsNPF3.1Chr6 ‑8741040Fa： gaaggtgaccaagttcatgcttatagatgaagcatgagaacaca ttaa， 正向引物 OsNPF3.1Chr6 ‑8741040Fg： gaaggtcggagtcaacggattatatagatgaagcatgagaacac attag， 反向引物O sNPF3.1C hr6_8741040R： ctataca aaatcgcaactttaatgtaac； 另外包含两条通用引物， 分别与两条正向引物中有下划线的部分一致， 两条通用引物 尾部加有不同的荧 光标记：权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114561488 A 2#1： gaaggtgaccaagttcatgct， #2： gaaggtcggagtcaacggatt； (6)OsNPF3.1Chr6 ‑8741040的使用： 标记的3条根据OsNPF3.1基因序列设计的引物及两条 通用荧光引物同时加入到P CR反应体系进 行扩增。 OsNPF3.1等位基因序列可以根据SNP差异 与正向引物OsNPF3.1Chr6_8741040Fa匹配而扩增获得FAM荧光信号值， 与正向引物 OsNPF3.1Chr6_8741040Fg匹配而扩增获得HEX荧光信号值； 如果水稻样品在该位点为杂合状 态， 则两种正向引物同时扩增； (7)OsNPF3.1Chr6_8741040扩增产物检测： PCR产物在包含FAM、 HEX和ROX三种荧光检测通道 的酶标仪中进行快速检测， 读取荧光 强度信号值， 然后将荧光信号值文件通过SNP  decoder (http://www.snpway.com/snpdecoder01/)软件分析， 获得每个样品扩增的FAM和HEX荧光 信号强度， 并对每个信号点用图形方式输出， 最后根据荧光信号强度， 自动进行基因分型， 获得基因型结果； 根据荧光信号值进 行分析， 荧光扫描获得FAM荧光信号蓝色的是OsNPF3.1 等位基因A类型材料， 获得HEX荧光信号绿色的是氮肥不敏感G类型材料， 灰色为阴性对照材 料； (8)OsNPF3.1Chr6_8741040有效性评估： 利用OsNPF3.1Chr6_8741040检测154份水稻材料的氮 肥利用效率， 结合表型 数据， 评估准确率。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114561488 A 3