(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210370981.3 (22)申请日 2022.04.11 (71)申请人 山东省动物疫病预防与控制中心 （山东省人畜共患病流调监测中心） 地址 250010 山东省济南市历城区唐冶西 路4566号 (72)发明人 王贵升　蔡晓庆　孙圣福　姜世金　 田夫林　刘维全　 (74)专利代理 机构 北京高沃 律师事务所 1 1569 专利代理师 薛红凡 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/686(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种基于双重微滴式数字PCR检测水貂阿留 申病毒和水貂肠炎病毒的引物探 针组及试剂盒 (57)摘要 本发明提供了一种基于双重微滴式数字PCR 检测水貂阿留申病毒和水貂肠炎病毒的引物探 针组及试剂盒， 属于动物疫病检测技术领域。 所 述引物探针组如下： AMDV ‑F如SEQIDNO： 1所示； AMDV‑R如SEQIDNO： 2所示； AMDV ‑P如SEQIDNO： 3所 示； MEV‑F如SEQIDNO： 4； MEV ‑R如SEQIDNO： 5； MEV ‑ P如SEQIDNO： 6。 本发明建立的方法， 通过临床样 品对该方法进行临床的初步应用， 此方法经多次 实验证明可行， 为以后水貂养殖场阿留申病、 水 貂肠炎的诊断和净化提供一种操作简单、 快速灵 敏的检测方法， 为水貂种质资源的保护和品种优 化提供重要兽医技 术指导。 权利要求书2页 说明书10页 序列表2页 附图5页 CN 114736990 A 2022.07.12 CN 114736990 A 1.一种基于双重微滴式数字PCR检测水貂阿留申病毒和水貂肠炎病毒的引物探针组， 其特征在于， 包括检测水貂阿留申病毒的引物探针组和检测水貂肠炎病毒的引物探针组； 所述检测水貂阿留申病毒的引物探针组包括正向引物AMDV ‑F、 反向引物AMDV ‑R和探针 AMDV‑P； 所述正向引物 AMDV‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO:1所示； 所述反向引物 AMDV‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO:2所示； 所述探针AMDV ‑P的核苷酸序列如SEQ  ID NO:3所示； 所述检测水貂肠炎病毒的引物探针组包括正向引物MEV ‑F、 反向引物MEV ‑R和探针MEV ‑ P； 正向引物M EV‑F的核苷酸序列如SEQ  ID NO:4所示 反向引物M EV‑R的核苷酸序列如SEQ  ID NO:5所示 探针MEV‑P的核苷酸序列如SEQ  ID NO:6所示； 所述探针AMDV ‑P和探针M EV‑P的5’端分别标记不同的荧 光基团； 所述探针AMDV ‑P和探针M EV‑P的3’端分别标记不同的猝灭基团。 2.权利要求1所述引物探针组在制备同时检测水貂阿留申病 毒和水貂肠炎病毒的试剂 盒中的应用。 3.一种基于双重微滴式数字PCR检测水貂阿留申病毒和水貂肠炎病毒的试剂盒， 其特 征在于， 包括权利要求1所述引物探针组。 4.根据权利要求2所述试剂盒， 其特 征在于， 还 包括2×supermix反应液。 5.一种非诊断目的的同时检测水貂阿留申病毒和水貂肠炎病毒的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 1)提取待测样品的DNA； 2)配制双重数字PCR反应 体系； 3)将步骤2)配制的双重数字PCR反应 体系进行 数字PCR扩增， 读取微 滴信号； 4)根据步骤3)中所述微滴信号的荧光种类， 判断感染水貂阿留申病毒还是水貂肠炎病 毒， 再根据具体的微滴信号的强度与对应的病毒标准 曲线进行比对， 得到对应病毒的定量 结果。 6.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述双重数字PCR反应体系共30μL如下： 400nM AMDV‑F 1.2 μL、 400nM  AMDV‑R 1.2 μL、 200nM  AMDV探针0.6 μL、 400nM  MEV‑F 1.2 μL、 400nM MEV‑R 1.2 μL、 200nM  MEV‑P 0.6 μL、 2×supermix反应液15 μL、 去离子水4 μL和DNA5 μ L。 7.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述双重数字PCR的反应程序如下： 95℃ 10min； 94℃30sec， 60℃60sec， 40个 循环； 12℃5mi n。 8.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 当探针AMDV ‑P标记FAM ‑BHQ1时， 微滴信号产 生蓝色荧 光信号， 判断样本中感染水貂阿留申病毒； 当探针MEV ‑P标记VIC ‑BHQ2时， 微滴信号产 生绿色荧光信号， 判断样本中感染水貂肠炎 病毒。 9.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述水貂阿留申病毒的标准曲线是以AMDV质 粒标准品为样本， 在1.43 ×108copies/ μL浓度基础上， 分别稀释经10‑1、 10‑2、 10‑3， 10‑4， 10‑5，权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114736990 A 210‑6， 10‑7， 10‑8稀释， 进行 数字PCR检测， 得到的荧 光信号与不同稀释浓度绘制曲线得到 。 10.根据权利要求5所述方法， 其特征在于， 所述水貂肠炎病毒的标准曲线是以MEV质粒 标准品为样本， 在1.82 ×108copies/ μL浓度基础上， 分别稀释经10‑1、 10‑2、 10‑3， 10‑4， 10‑5， 10‑6， 10‑7， 10‑8稀释， 进行 数字PCR检测， 得到的荧 光信号与不同稀释浓度绘制曲线得到 。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114736990 A 3