(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210380687.0 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 山东省农业科 学院作物研究所 地址 250100 山东省济南市历城区工业北 路202号 (72)发明人 汪晓璐　韩冉　徐文竞　王开　 祁广　曾小雪　訾妍　刘成　 李法计　翟胜男　程敦公　郭军　 刘爱峰　李豪圣　曹新有　宋建民　 刘建军　 (74)专利代理 机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 1 1246 专利代理师 刘妮 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的 dCAPS分子标记及应用 (57)摘要 本发明公开了希尔斯山羊草基于基因组重 测序SNP的dCAPS分子标记及应用。 本发明通过对 希尔斯山羊草基因组重测序SNP的分析， 开发了2 个dCAPS分子标记， 这2对引物均 能在中国春 ‑希 尔斯山羊草附加系中扩增出不同的多态性条带， 而在不含有希尔斯山羊草染色体的中国春等普 通小麦中无法扩增出特异条带。 这2个分子标记 可作为希尔斯山羊草特异性标记应用于检测小 麦和希尔斯山羊草的杂交后代， 可有效服务于小 麦和希尔斯山羊草杂交种的育种工作， 为小麦近 缘物种标记开发提供新的研究思路。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114606341 A 2022.06.10 CN 114606341 A 1.用于检测希尔斯山羊草SNP位点的dCAPS分子标记， 其特征在于， 所述的dCAPS 分子标 记为AESD23引物或AESD 105引物， 所述AESD23引物的上、 下游核苷酸序列如SEQ  ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示， 所述AESD105引物的上、 下游核苷酸序列如SEQ  ID NO.3和SEQ  ID NO.4 所示。 2.一种鉴定 中国春‑希尔斯山羊草杂交后代的方法， 其特征在于， 包括采用如权利要求 1所述的引物进 行PCR扩增， 并通过限制性内切酶对PCR产 物酶切处理， 根据电泳结果判断待 检测中国春 ‑希尔斯山羊草杂交后代： 若以AESD23引 物进行PCR的电泳结果显示有一条1800bp的多态性条带， 则检测后代为 中国春‑希尔斯山羊草1Ss附加系； 若以AESD105引物进行PCR的电泳结果显示有两条200bp和300bp的多态性条带， 则检测 后代为中国春 ‑希尔斯山羊草3Ss附加系。 3.根据权利要求2所述的鉴定方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1.提取待检测杂交后代的全基因 组DNA； S2.采用所述dCAP S分子标记的引物并以S1步骤所 得的DNA作模板进行PCR扩增； S3.使用dCAP S分子标记所对应的限制性内切酶对PCR产物酶切处 理； S4.对酶切产物进行凝胶电泳， 根据酶切产物的带 型判断该检测后代。 4.根据权利要求2所述的鉴定方法， 其特征在于， 所述的PCR扩增反应体系包括DNA模 板、 2×PCRmix、 上游引物、 下游引物和无菌双蒸馏水。 5.根据权利要求2所述的鉴定方法， 其特 征在于， 所述的PCR扩增反应程序为： 94℃预变性3mi n； 35个循环的94℃变性3 0s、 56℃退火3 0s、 72℃延伸1mi n； 以及 72℃延伸10mi n。 6.一种用于鉴定 中国春‑希尔斯山羊草杂交后代的试剂 盒， 其特征在于， 所述的试剂 盒 包括如权利要求1中所述的引物和限制性内切酶Hae Ⅱ或XhoI； 其中， 所述的AESD23引物采 用的限制性内切酶为Hae Ⅱ； 所述的AES D105引物采用的限制性内切酶为Xho I。 7.如权利要求1所述的分子标记在种子鉴定中的应用； 其中， 所述的种子包括普通小麦 和中国春与希尔斯 山羊草的杂交后代。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114606341 A 2希尔斯山羊草 基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及应用 技术领域 [0001]本发明涉及希尔斯 山羊草基于基因 组重测序SNP的dCAP S分子标记及应用。 背景技术 [0002]小麦(Triticum  aestivum， 异源六倍体物种)是世界上最重要的粮食作 物之一， 为 人类提供约20％的能量。 近年来， 中 国小麦种植面积稳定在2400万 公顷左右， 占全球小麦种 植面积的10.9％。 然而， 由于近几十年来少数优异亲本的广泛使用以及新病原菌的变异， 导 致我国小麦生产面临着遗传基础狭窄及抗病性 丧失快的双重问题。 [0003]小麦近缘种属中蕴藏着丰富的优异性状， 如抗病、 抗旱、 抗虫和耐盐等特性， 为小 麦的遗传改良提供珍贵的基因资源。 山羊草属(Aegilops)包含20多个物种， 广泛分布于世 界各地， 是小麦抗病基因的重要来源。 希尔斯山羊草(Ae.Searsii  Feldman&Kislevex   Hammer， 2n＝2x＝14， SsSs)是二倍体S基因组物种， 来源于以色列、 约旦、 叙利亚西南部和黎 巴嫩东南部的亚地中海地区。 希尔斯山羊草高抗小麦叶锈病和白粉病、 秆锈病以及禾谷类 二叉蚜虫， 对干旱和盐胁迫也有较好的抗 性。 [0004]分子标记对小麦背景 中近缘物种染色体的鉴定和追踪有重要作用。 目前应用最为 普遍的基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记主要有简单重复序列标记(SSR)、 竞争性等位 基因特异性PCR(KAPS)和限制性内切酶多态性(CAPS)标记。 CAPS标记是在序列信息及单核 苷酸多态性(SNP)位点已知的条件下， 对P CR产物进行限制性内切酶酶切而产生长度多态 性 的目标片段。 由于多数SNP不在限制性内切酶位点上， 不能直接转化为CAPS标记， 人们常通 过PCR在SNP位点的侧翼引入突变碱基， 将其改造为限制性内切酶位点， 进而产生长度多态 性的目标片段， 这一标记技术被称为衍生限制性内切酶多态性标记(dCAPS)， 具有共显性， 位点特异性， 操作简单， 成本低等特点， 目前已成功用于作物分类和辅助育种。 [0005]为鉴定已获得的中国春 ‑希尔斯山羊草杂交后代1Ss～7Ss附加系， 由于分子 标记的 缺乏极大地限制了这批杂交后代材料的精确鉴定。 因此本发明基于希尔斯山 羊草重测序的 SNP分析， 开发了希尔斯山羊草新的dCAPS分子标记， 为小麦背景中希尔斯山羊草染色体的 检测提供新的手段。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供了希尔斯山羊草基于基因组重测序SNP的dCAPS分子标记及 应用， 基于希尔斯山羊草重测序的SNP分析， 开发了希尔斯山 羊草新的dCAPS分子标记， 解决 了中国春 ‑希尔斯山羊草杂交后代1Ss～7Ss附加系难以精确鉴定的问题， 为小麦背景中希尔 斯山羊草染色体的检测提供新的手段。 [0007]本发明通过对希尔斯山羊草基因组重测 序， 提供了希尔斯山羊草的两个S NP位点， AESD23位点位于1Ss染色体上， 对比中国春， 其碱基由G突变成C； AESD105位点在3Ss染色体 上， 对比中国春， 其碱基由C突变成G。 [0008]本发明分别提供了用于检测上述两个S NP位点的dCAPS分子标记， 其引物核苷酸序说　明　书 1/6 页 3 CN 114606341 A 3