(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210380681.3 (22)申请日 2022.04.12 (71)申请人 广西中医药大学 地址 530200 广西壮 族自治区南宁市青秀 区五合大道13号 (72)发明人 黄勇　刘静　梁肖彩　颜琳妙　 李宏宇　王乙淋　 (74)专利代理 机构 北京远大卓悦知识产权代理 有限公司 1 1369 专利代理师 许文宗 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 蟾酥鉴定的分子鉴定方法 (57)摘要 本发明公开了一种蟾酥鉴定的分子鉴定方 法， 利用蟾酥线粒体基因16S  rRNA对蟾酥进行分 子鉴定， 包括以下步骤： 提取蟾酥样品总DNA， 利 用蟾酥样品总DNA扩增16S  rRNA， 电泳检测扩增 产物并对扩增产物进行测序， 将测序获得的16S   rRNA序列与数据库进行比对， 并构建系统发育 树， 根据比对结果和系统发育树， 确定蟾酥的基 原物种。 本发明能够通过线粒体基因16S  rRNA对 收集到的蟾酥药材进行分子鉴定， 为蟾酥的基原 物种鉴定和蟾酥药 材质量标准 提供科学依据。 权利要求书1页 说明书12页 序列表28页 附图2页 CN 114672573 A 2022.06.28 CN 114672573 A 1.蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 利用蟾酥线粒体基因16S  rRNA对蟾酥进行 分子鉴定 。 2.根据权利要求1所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 提取 蟾酥样品总DNA， 利用蟾酥样品总DNA扩增16S  rRNA， 电泳检测 扩增产物并对扩增产物进行 测序， 将测序获得的16S  rRNA序列与数据库进 行比对， 并构建系统发育树， 根据比对结果和 系统发育树， 确定蟾酥的基原 物种。 3.根据权利要求2所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 利用动物组织DNA提 取试剂盒提取蟾酥样品总DNA。 4.根据权利要求3所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 取新鲜或干燥蟾酥， 置于洁净的离心管中， 在负80℃冷冻10 ‑20min， 经快速研磨仪研磨粉碎获得蟾酥样品。 5.根据权利要求3所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 向装有蟾酥样品的离 心管中加入GA缓冲液200 ‑300 μL再加入Proteinase  K 20‑30 μL混匀， 50 ‑60℃放置2 ‑3h， 取 上清液加入2 00‑30 μL的GB溶液， 混匀， 70 ‑75℃放置10 ‑15min； 加入200 ‑300 μL无水乙醇并混 匀； 转移到吸附柱中， 离心弃废液； 加 入GD缓冲液400 ‑500 μL； 离心， 弃废液； 加入PW缓冲液， 离心弃废液， 重复操作1次， 空管高速离心2 ‑3min， 室温 晾干30‑50min， 加入100 ‑200 μL双蒸 水洗脱DNA， 离心即得样 品总DNA模板， 采用超微量核酸蛋白检测仪测定浓度， ‑20℃保存备 用。 6.根据权利要求2所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 扩增16S  rRNA的PCR 反应体系总体积为25μL， 体系组分包含DNA模板1μL， Speed  STAR酶0.5μL， 缓冲液10XFB Ⅱ 2.5 μL， dNTP  mixture 2.5 μL， 正向引物16S  rRNA L3975、 反向引物 16S rRNA H4551各1μL， 加灭菌双蒸水d dH2O补足至25 μL。 7.根据权利要求6所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 正向引物16S  rRNA  L3975的序列 为SEQ ID NO.A： CGCCTGTTTACCAAAAACAT； 反向引物16S  rRNA H4551的序列为 SEQ ID NO.B： CCGGTCTGAACTCAGATCACGT。 8.根据权利要求6所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， PCR扩增16S  rRNA时 的反应条件为： 预变性温度为95℃， 5min， 变性温度为94℃， 30s， 退火温度为52℃， 45s， 延伸 温度为72℃， 1mi n， 最后延伸72℃， 10mi n， 35个循环。 9.根据权利要求2所述的蟾酥鉴定的分子鉴定方法， 其特征在于， 将测序获得的 16SrRNA序列用BioEdit软件进行比对， 人工校对， 将最终目的序列提交到NCBI数据库进行 BLAST比对， 在NCBI的GenBank数据库上下载已发表的中华大蟾蜍和黑眶蟾蜍所有的16S   rRNA的序列， 然后与16S  rRNA序列一起比对， 利用MEGA  6.0基于Ki mura‑2‑parameter模型， 使用NJ法构建系统发育树， 进 行重复分析检验置信度， 结合BLAST比对和NJ树的结果最终确 定蟾酥的基原 物种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672573 A 2蟾酥鉴定的分子鉴定方 法 技术领域 [0001]本发明属于分子生物学鉴定领域。 更具体地说， 本发明涉及一种蟾酥鉴定 的分子 鉴定方法。 背景技术 [0002]蟾酥来源于蟾蜍科动物 中华大蟾蜍(Bufo  bufo gargarizans  Cantor)或黑眶蟾 蜍(Bufo melanostictus  Schneider)的干燥分泌物， 是一味名贵的动物中药， 主产于山东、 江苏、 安徽、 河南、 河北、 辽宁、 吉林及黑龙江等地， 性 温， 味辛， 有毒， 具有解毒、 止痛、 开窍 醒 神的功效， 用于痈疽疔 疮、 咽喉肿痛、 中暑神昏、 痧胀腹痛吐泻等。 [0003]蟾酥的化学成分具有相当高的药用价值， 有蟾蜍内酯类、 吲哚类生物碱、 甾醇类及 其他类化合物， 临床 研究主要在抗癌方面， 在宫颈癌、 食管癌、 肝癌、 肺癌等方面 都有相关报 道， 主要是通过抑制肿瘤细胞增殖、 诱导癌细胞凋亡等 发挥抗癌作用， 且在临床应用中取得 了很好的疗效。 有医药公司通过建设蟾蜍、 蟾酥的生产基地缓解蟾酥资源的稀缺， 但是从幼 蟾到成蟾死亡率高的难题尚未克服， 蟾酥价格昂贵， 资源稀缺， 需求日益增高， 导致市场的 加工品中常常出现掺伪品、 伪制品， 蟾酥药材质量参差不齐。 其为特殊管理的28种毒 麻中药 品种之一， 蟾酥在其安全性方面同样受到重视， 由于治疗剂量与中毒剂量接近， 严格控制蟾 酥药材及饮片的质量尤为重要， 不良反应较常见。 蟾酥在临床应用的成方制剂除了六神丸、 麝香保心丸等， 也 随着生产技术的进步逐渐产生了蟾酥类脂质体制剂、 蟾酥类纳米粒制剂 等新剂型， 增加了蟾酥的延展性， 也减少毒副反应。 由于蟾酥资源的稀少， 市场上蟾酥的伪 劣品以混合酥最为多 见， 主要是掺杂淀粉、 蛋清、 泥沙等杂质。 虽然有研究表明可通过性状、 显微和理化的方法， 可以较好地鉴别蟾酥药材的伪品和易混 品。 而对于蟾酥的来源， 比如来 源于中华蟾蜍和黑眶蟾蜍的蟾酥混合在一起， 或者其他品种来源的蟾酥和正品蟾酥混合在 一起等， 使用性状、 显微和理化 等方法， 均难以进行其 来源鉴别。 [0004]随着分子生药学的发展， 分子鉴定技术在中药材的鉴别中得到不断的应用， 传统 鉴定方法也逐渐 向数字化技术发展， DNA分子鉴定技术是近年来动物类中药鉴定中较为重 要的分子生物技术。 利用线粒体基因对动物的物种鉴定已经有许多报道， 比如杜鹤等人基 于COI对麝香及混伪品的鉴定、 高晓悦等人基于COI和16S  rRNA序列对地龙及其混淆品进行 了物种间的鉴定、 尹艳等人基于C ytb序列对穿山甲及混伪品进 行了鉴定、 Bely人等基于COI 序列对水蛭的鉴定、 张红 印等人基于C OI序列对蛤蚧及其混伪品的鉴定， 研究结果表明均能 较好的鉴别物种的真伪。 从分子水平对 药材来源进 行分析,达到了准确、 客观 鉴别中药材真 伪的目的， 2010年版 《中华人民共和国药典》 正式纳入了中药DNA条形码分子鉴定的指导原 则， 标志着 中药分子鉴定已成为继四大经典鉴定方法之后的一种新的鉴定方法， 大程度 弥 补了蟾酥 药材在性状、 显微和理化 等方法的不足。 发明内容 [0005]本发明的一个目的是解决至少上述问题， 并提供至少后面将说明的优点。说　明　书 1/12 页 3 CN 114672573 A 3