(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210394569.5 (22)申请日 2022.04.13 (71)申请人 福建省农业科 学院畜牧兽医研究所 地址 350013 福建省福州市晋安区新店镇 埔垱100号 (72)发明人 陈翠腾　朱春华　陈珍　刘斌琼　 蔡国漳　张世忠　林琳　万春和　 黄瑜　江斌　 (74)专利代理 机构 福州创蔚来知识产权代理有 限公司 3 5290 专利代理师 郑艳艳 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR检测的引 物和探针及其试剂盒 (57)摘要 本发明提供一种鸽轮状病毒A型荧光定量 PCR检测的引物和探针及其试剂盒， 所述引物序 列 如 下 ：引 物 P i R V A ‑T F ：5 ’‑ CCGAACTGCT CCTGTATGAAT‑3’， 引物PiRVA ‑TR： 5’ ‑ CATTGCCCATTGCTATCCATTT ‑3’； 所述探针为： 探针 P i R V A ‑p r o b e ： 5 ’ ‑ AGTCTGACA TCCATTTCATTGCACAACC ‑3’， 且其5’ ‑端 标记荧光报告基团FAM， 在探针的中间和3 ’ ‑端分 别标记淬灭基团DBQ1， 本发明建立的方法灵敏度 高、 稳定性好、 特异性强、 重复性好， 可用于鸽轮 状病毒A型特异性检测， 为后续科学研究鸽轮状 病毒A型致病机理和开展分子流行病学奠定基 础。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 114807440 A 2022.07.29 CN 114807440 A 1.一种鸽轮状病毒A型实时荧光定量PCR检测的引物和探针， 其特征在于： 所述引物序 列如下： 引物PiRV A‑TF： 5’ ‑CCGAACTGCTCCTGTATGA AT‑3’， 引物PiRV A‑TR： 5’ ‑CATTGCCCATTGCTATCCATTT‑3’； 所述探针的序列为： 探针PiRVA ‑probe： 5’ ‑AGTCTGACATCCATTTCATTGCACAACC ‑3’， 且其5’ ‑端标记荧光报告 基团FAM， 在探针的中间和3 ’ ‑端分别标记淬灭基团DBQ1。 2.如权利要求1所述的引物和探针在制备鸽轮 状病毒A型 特异性检测试剂盒中的应用。 3.一种鸽轮状病毒A型实时荧光定量PCR检测试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒包括权 利要求1所述的引物和探针。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807440 A 2一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR检测的引物和探针及其试 剂盒 技术领域 [0001]本发明属于动物病毒学领域， 具体涉及一种鸽轮状病毒A型荧光定量PCR  检测的 引物和探针及其试剂盒。 背景技术 [0002]人类养鸽历史悠久， 鸽经驯化成观赏鸽、 赛鸽和肉鸽， 拥有较强的免疫系统， 加上 鸽舍多采用开放式或半开放式， 空气流通好， 空气新鲜， 相比较其他畜禽， 鸽生病较少。 然 而， 随着养 鸽业规模化、 集约化的迅速发展， 饲养总量、 饲养密度的增加， 鸽的饲养方式发生 了改变， 由于饲养管理水平低， 疫病防治意识差， 加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比 赛)， 鸽病也越来越多， 越来越严重， 越来越复杂。 近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽 业， 据国内外研究， 已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、 鸽轮状病毒感染、 鸽腺病毒感 染、 鸽圆环病毒感染、 鸽疱疹病毒感染、 鸽痘和H9亚型低致病性 禽流感等。 [0003]轮状病毒(Rotavirus， RV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属， 病毒粒子无囊膜， 呈正 二十面体， 分3层壳体， 直径约75nm， 在电镜下呈车轮状， 由此得名。 轮状病毒基因组由11节 段双链RNA构成， 各段长663～3302bp。 根据国际病毒分类委员会(International   Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)的最新 分类， 轮状病毒属包 括A～J共10个病毒 种。 至今轮状病毒A型、 D型、 F型和G型均能感染禽类， 截至目前轮状病毒A型、 D型和G型均能 感染鸽子。 轮状病毒同一病毒种的不同宿主的毒株之间的基因序列往往差异明显。 轮状病 毒A型(Rotavirus  A， RVA)一般感染特定种群的动物， 此类病毒称为同源株， 但偶尔也存在 跨种传播现象。 轮状病毒A型宿主广泛， 广泛存在于哺乳动物和禽类， 禽类感染后临床症状 主要表现为严重腹泻、 脱水、 发育不良和死亡率增加。 鸽感染轮状病毒A型以呕吐、 腹泻、 脱 水和泄殖腔炎为特征。 病鸽在病初精神差， 食欲减退， 消化功能紊乱。 继而萎靡、 嗜睡、 不食 和剧烈腹泻， 粪便呈水样， 严重脱水， 体瘦， 贫血， 最后因衰竭而死亡。 剖检病变主要表现为 肝脏坏死和肠道黏膜充 血、 出血和水肿， 另外机体脱 水， 泄殖腔发炎。 轮状病毒A型感染已严 重影响了 养鸽业的健康发展。 [0004]实时荧光定量PCR方法(Real ‑time PCR)是一种在DNA扩增反应中， 以荧光化学物 质检测每次聚合酶链 式反应(PCR)循环后产物总量的方法。 实时荧光定量PCR在PCR扩增过 程中， 通过荧光信号， 对PCR进程进行实时监测。 由于在PCR扩增的指数期， 模板的Ct值和该 模板的起始拷贝数存在线性关系。 荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物， 探针法的出现使得定量  PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。 TaqMan探针法是指在 Real‑time PCR扩增反应体系中除了加入一对引物， 还同时加入一个特异 性的荧光探针， 该 探针只与模板特异性地结合， 其结合位点在两条引物之间。 探针的5 ′端标记有荧光报告基 团， 3′端标记有荧光淬灭基团。 当探针完整的时候， 5 ′端报告基团经仪器光源激发的荧光正 好被近距离的3 ′端荧光基团淬灭， 仪器检测不到5 ′端报告基团所激发的荧光信号。 随着 Real‑time PCR的进行， Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 其5 ′ ‑3′外切酶活性说　明　书 1/6 页 3 CN 114807440 A 3