(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210388045.5 (22)申请日 2022.04.14 (71)申请人 广东省科 学院生物与医学工程研究 所 地址 510316 广东省广州市海珠区江海大 道中(原石榴岗路10号) (72)发明人 谭凯月　邹丽丽　吕倩　杨泽锐　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 齐键 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其 应用 (57)摘要 本发明公开了一种检测ctDNA的恒温无酶系 统的构建及其应用。 该恒温无酶系统基于发夹序 列H1、 发夹序列H2和Reporter ‑F和Reporter ‑Q构 成， 发夹序列H1和发夹序列H2在目标ctDNA的引 发下， 相互杂交形成稳定的双链DNA复合物(H1‑ H2)。 Reporter ‑F与发夹序列H1的序列D部分互补 配对， 且配对碱基数大于与Reporter ‑Q的配对碱 基数。 本发明中的恒温无酶系统对于ctDNA的检 测限可以达到7pM， 具有较高的信号增益、 低背 景、 较好的选择性和特异性以及较好的血清稳定 性， 为乳腺癌的早期筛查提供了有效的技术支 持。 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 附图6页 CN 114774543 A 2022.07.22 CN 114774543 A 1.一种ctDNA检测探针组， 其特征在于， 所述ctDNA检测探针组包括发夹序列组和报告 序列组； 所述发夹序列组包括发夹序列H1和发夹序列H2； 所述发夹序列H1包括序列A， 序列B， 序列C和序列D； 所述序列A和序列B靶向结合目标ctDNA； 所述发夹序列H2包括序列E和序列F； 所述序列E与所述序列B和序列C互补配对， 且序列C 的碱基数 大于序列A的碱基数； 所述发夹序列H1和发夹序列H2在目标ctDNA的引发下， 相互杂交形成稳定的双链DNA复 合物； 所述报告序列组包括Repor ter‑F和Repor ter‑Q； 所述Repor ter‑F与Repor ter‑Q互补配对； 所述Reporter ‑F与所述序列D互补配对， 且配对碱基数大于与Reporter ‑Q的配对碱基 数。 2.根据权利要求1所述的ctDNA检测探针组， 其特 征在于， 所述ctDNA为乳腺癌ctDNA。 3.根据权利要求2所述的ctDNA检测探针组， 其特征在于， 所述ctDNA的核苷酸序列为： 5’ ‑CTCAGTGAT TTTAGAGAGAG GAT‑3’。 4.根据权利要求1所述的ctDNA检测探针组， 其特 征在于， 所述发夹序列H1的核苷酸序列为： 5 ’ ‑ATCCTCTCTCTAAAATCACTGAGCCATGTGTAGACTCAGTG ATTTTAGACCTTGTCATAGAGCAC ‑3’； 所述发夹序列H2的核苷酸序列为： 5 ’ ‑TCACTGAGTCTACACATGGCTCAGTGATTTTAGACCATGTG TAGA‑3’； 所述Repor ter‑F的核苷酸序列为： 5 ’ ‑CGAGTGCTCTATGACA AGGTCTAAAA‑3’； 所述Repor ter‑Q的核苷酸序列为： 5 ’ ‑CCTTGTCATAGAGCACTCG ‑3’。 5.根据权利要求1所述的ctDNA检测探针组， 其特征在于， 所述Reporter ‑F与Reporter ‑ Q中的一条 连接有荧 光基团， 另一条 连接有淬灭基团。 6.一种检测试剂， 其特征在于， 所述检测试剂中含有权利要求1～5中任一项所述的 ctDNA检测探针组。 7.权利要求1～5中任一项所述的ctDNA检测探针组在制备ctDNA检测产品中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述产品包括检测试剂、 检测试剂 盒、 检测 芯片。 9.根据权利要求7 所述的应用， 其特 征在于， 所述ctDNA检测产品的使用方法为： (1)分别将权利要求1～5中的发夹序列H1、 发夹序列H2和报告序列组退火， 获得具有折 叠结构的发夹序列H1和H2、 以及报告分子复合物； (2)混合具有折叠结构的发夹序列H1和H2、 以及报告分子复合物， 加入检测样品， 37 ±1 ℃下反应至少3 5min， 对比反应前后的荧 光强度变化， 判断检测样品中是否含有目标ctDNA。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 步骤(2)中的判断标准 为： (1)若反应前后的荧 光强度无显著差异， 则检测样品中不含目标ctDNA； (2)若反应前后的荧 光强度存在显著差异， 则检测样品中含有目标ctDNA。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774543 A 2一种检测ctDNA的恒 温无酶系统的构建及其应用 技术领域 [0001]本发明属于基因检测领域， 具体涉及一种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其 应用。 背景技术 [0002]循环肿瘤DNA(ctDNA)是由肿瘤细胞在凋亡或坏死过程中释放到血液中的基因组 片段， 携带有肿瘤特异性的遗传学信息。 ctDNA通常由90～150个核苷酸构成。 ctDNA具有组 织特异性， 在乳腺癌患者的血清中异常表达。 此外， ctDNA在血液中的半衰期较 短， 一般小于 2h， 而大多数蛋白生物标志物的半衰期可达数周。 因此， ctDNA更能反馈肿 瘤的实时状态信 息。 作为液体活检的有效肿瘤标志物， ctDNA检测可以为乳腺癌的早期诊断和病理分型提供 重要的、 准确可靠的理论和实验证据。 但ctDNA作为肿瘤标志物在乳 腺癌患者血清中的丰度 很低， 对于 现有的ctDNA检测带来了一定的困难。 因此需要发展一种检测效果更加准确且检 测限更低的ctDNA检测方法以用于实际的ctDNA检测中。 [0003]相关技术中， 用于ctDNA检测的信号扩增方法主要有逆转录聚合酶链式扩增(RT ‑ PCR)、 DNA测序和酶辅助的信号扩增。 其中， RT ‑PCR方法操作繁琐， 需要严格 设计引物并依赖 精密的循环温控仪器。 DNA测序方法操作耗时， 通常需要2 ‑3周， 成本比较高。 而对于酶辅助 的信号扩增， 虽然酶辅助的信号扩增中酶的活性比较高， 但它需要严格控制酶的活性， 操作 环境比较苛刻， 且制备 过程复杂、 繁琐， 因此其应用受到较大的限制。 发明内容 [0004]本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。 为此， 本发明提出一 种检测ctDNA的恒温无酶系统的构建及其应用。 本发 明中的用于检测ctDNA的恒温无酶系统 检测时间短、 操作便捷且灵敏度高， 且具有较高的信号增益、 低背景、 较好的选择性和特异 性以及较好的血清稳定性， 通过该系统能够有效实现血清中丰度较低的肿瘤标志物ctDNA 的高灵敏度检测， 从而获得癌症早期诊断的ctDNA表达谱特征， 为癌症的早期诊断提供坚实 的技术支持。 [0005]本发明的第一个方面， 提供一种ctDNA检测探针组， 该ctDNA检测探针组包括发夹 序列组和报告序列组； [0006]所述发夹序列组包括发夹序列H1和发夹序列H2； [0007]所述发夹序列H1包括序列A， 序列B， 序列C和序列D； [0008]所述序列A和序列B靶向结合目标ctDNA； [0009]所述发夹序列H2包括序列E和序列F； 所述序列E与所述序列B和序列C互补配对， 且 序列C的碱基数 大于序列A的碱基数； [0010]所述发夹序列H1和发夹序列H2在目标ctDNA的引发下， 相互杂交形成稳定的双链 DNA复合物(H1‑H2)； [0011]所述报告序列组包括Repor ter‑F和Repor ter‑Q；说　明　书 1/10 页 3 CN 114774543 A 3