(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210408089.X (22)申请日 2022.04.19 (71)申请人 连云港市第二人民医院(连云港市 临床肿瘤研究所） 地址 222000 江苏省连云港市海州区幸福 路161号 (72)发明人 高绪柱　王蕾　王方　苗永昌　 (74)专利代理 机构 无锡苏元专利代理事务所 (普通合伙) 32471 专利代理师 王清伟 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01) C12Q 1/6804(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01)C12R 1/74(2006.01) (54)发明名称 热带念珠菌的RPA-LFS检测引物探针组合及 其应用 (57)摘要 本发明公开了一种热带念 珠菌的RPA ‑LFS检 测引物探针组合及其应用， 利用RPA ‑LFS扩增热 带 念 珠 菌 内 转 录 2 区 ( i n t e r n a l   transcribedspacer ‑2， ITS2)基因， 通过引入碱 基错配优化引物探针设计， 从而获得特异性强、 灵敏度高的引物探针组合用于临床样品检测， 针 对24种临床常见病原菌进行RPA ‑LFS检测， 对该 系统的检测系统的敏感性和特异性进行测定， 对 反应温度和时间进行优化， 对收集的196份不同 来源的临床实际样本进行检测， 用以评估所建立 RPA‑LFS系统检测性能， 为热带念珠菌的检测提 供可靠的分子诊断方法， 满足临床上快速、 灵敏、 实时、 便携的现场检测的迫切需要。 权利要求书1页 说明书7页 序列表3页 附图3页 CN 114807416 A 2022.07.29 CN 114807416 A 1.热带念珠菌的RPA ‑LFS检测引物探针组合， 其特征在于， 包括ITS2 ‑F5/R1B/P引物探 针组合； ITS2‑F5的序列为： TGA ACAAATTTCTTTGGTGGCGGGAGCAATC； ITS2‑R1B的序列为Bi otin‑GAACATCTTCACTTCATATTACGTATCGCAT TT； ITS2‑P的序列为： FITC‑TTATTATTACAGTAGTCA ACACTTTCAGCAACGGATC[THF]CT TGATTCTCGCATC ‑C3 spacer。 2.权利要求1所述的引物探针组合在热带念珠菌的RPA ‑LFS检测引物探针组合检测中 或检测试剂盒的制备中的应用。 3.如权利要求1所述的应用， 其特征在于， RPA ‑LFS的条件为在39℃下孵育RPA反应20分 钟。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807416 A 2热带念珠菌的R PA‑LFS检测引物探针组合及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及热 带念珠菌的RPA ‑LFS检测引物探针组合及其应用。 背景技术 [0002]热带假丝酵母菌(Candida  tropicalis)， 即热带念珠菌， 属隐球酵母目、 隐球酵母 科， 是常见的假丝酵母。 酵母菌的过度生长引起的假丝酵母菌亦称念珠菌(Candida)， 可侵 犯皮肤、 粘膜和内脏， 表现为 急性、 亚急性或慢性炎症， 大多为 继发性感染。 假丝酵母菌种类 很多， 但能对人致病的仅有几种， 热带假丝酵母菌(C.tropicalis)， 是仅次于白色念 珠菌的 第二大常见致病真菌， 其 他致病念珠菌还 包括光滑念珠菌， 克柔念珠菌， 近平 滑念珠菌等。 [0003]传统真菌培养法是真菌感染性疾病诊断的金标准， 可以从痰、 尿、 大便、 血液、 各种 分泌物、 胸腹水等各种标本中检测Candida  tropicalis感染。 另外， 临床上多使用显色法从 众多种念珠菌中区分热带念珠菌， 但是， 和传统真菌培养法法类似， 显 色法存在耗时长这一 不足之处， 其中， 某些显色法中， 热带念珠菌的检测易与光滑念珠菌混淆， 不能准确 地对热 带念珠菌进行 快速的检测。 因此， 建立快速、 有效的检测热 带念珠菌的方法尤为重要。 [0004]随着分子诊断技术的不断发展， 基于核酸检测的PCR、 qPCR、 以及LAMP等也越来越 多的被应用在热带念珠菌的检测中。 尤其是等温扩增由于不受仪器和实验室场景限制， 更 是在现场检测中越来越多的受到重视。 重组酶聚合酶扩增(Recombinase  Polymerase   Amplication， RPA)技术是最近兴起的恒温扩增技术， 能够兼顾以上方法的优点， 弥补不足， 满足快速、 实时、 灵敏及便携的快速诊断需求的检测方法。 RPA与其他技术相比该技术具有 更好的特异性、 灵敏度和操作便携性。 RPA利用重组酶打开双链并使引物与目的片段结合， 利用具有链置换活性的聚合酶Bsu识别引物3 ’端进行稳定扩增， 只需在30 ‑45℃反应20min 即可获得 大量的扩增产物。 [0005]RPA的扩增产物 可以用凝胶电泳、 荧光检测器和侧流条(LFS)进行检测。 然而， 在实 验室外， 凝胶电泳和荧光检测的灵敏度是有限的。 相反， LFS适用于简单的检测， 检测结果可 以直观地分析， 而不需要复杂的热循环设备和经过培训的人员。 可视化取决于探针的5'和 3'端分别有一个异硫氰酸荧光素(FITC)标签和一个C3阻滞位点。 在探针的中间， 一个碱基 也被四氢 呋喃(THF)取代。 探针与扩增链的结合是通过内切酶IV(Nfo)的裂解开始的， 它释 放出探针的3'端进行延伸。 使用生物素标记的反向引物， 扩增产物的5'和3'端分别用FITC 和生物素标记。 LFS的共轭垫上的金纳米粒子标记(AuNP标记)的抗FITC抗体可以与扩增产 物结合， 随后被涂有链霉蛋白的检测线捕获并聚集， 如红色阳性信号所示。 RPA ‑LFS检测在 作为各种传染病的诊断性试验时， 可以达 到快速反应时间和良好的准确性。 [0006]目前RPA‑LFS已经越来越多的被应用于各种病原微生物的医学检验中， 本实验室 已报道的基于RPA ‑LFS技术建立检测方法的病原 微生物有铜绿假单胞菌、 新型隐球菌、 白色 念珠菌等， 本研究利用RPA ‑LFS技术， 建立一种Candida  tropicalis的快速检测技术， 用于 Candida tropicalis引发感染 的快速诊断。 建立快速检测真菌的方法,早期获取检测结果 可指导临床及时采取适当治疗方案， 大 大缩减病人诊 治过程。说　明　书 1/7 页 3 CN 114807416 A 3