(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210418809.0 (22)申请日 2022.04.20 (71)申请人 青岛国际旅行卫 生保健中心(青岛 海关口岸门诊部） 地址 266000 山东省青岛市 市南区福州南 路85号 (72)发明人 徐颖　王岩　闫吉辉　陈晓光　 刘海江　张瑾　梁洁　侯伟　张娟　 徐翮　滕新栋　 (74)专利代理 机构 北京东方昭阳知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11599 专利代理师 吕燕 (51)Int.Cl. C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/6844(2018.01)C12N 15/11(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 沙门氏菌的可视化检测试剂盒 (57)摘要 本发明提供沙门氏菌的可视化检测试剂盒， 包括： 标准结果对照品、 阳性标准品、 阴性标准 品、 核酸提取管、 核酸检测管、 检测液I、 检测液 II、 检测液III； 本发明在核酸提取过程和核 酸扩 增过程不需要昂贵的仪器设备， 检测特异性强， 灵敏度是PCR检测10 ‑100倍， 结果判读简单， 成本 低廉， 现场环 境或者基层都可以满足条件并开展 检测， 适合推广使用。 权利要求书2页 说明书12页 序列表2页 附图3页 CN 114606329 A 2022.06.10 CN 114606329 A 1.沙门氏菌的可视化检测试剂盒， 其特征在于， 所述沙门氏菌的可视化检测试剂盒包 括： 标准结果对照品、 阳性标准品、 阴性标准品、 核酸提取管、 核酸检测管、 检测液I、 检测液 II、 检测液I II； 所述核酸 提取管为包含100 μL‑500 μL的核酸 提取试剂的无菌 EP管； 所述标准结果对照品为可密封的PCR  8联排管中， 其中5管装有不同颜色液体； 所述阳性标准品为含有沙门氏菌标准菌株基因组D NA的溶液， 其中的DNA浓度为10‑2ng/ μL‑100ng/ μL， 优选1ng/ μL； 所述阴性标准品为 不含有核酸的无菌去离 子水； 所述核酸检测管为包 含RPA通用反应试剂冻干制剂的带盖PCR反应管； 所述检测液I为含有沙门氏菌检测上游引物F2和沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用 反应检测液， 所述检测液I中含有沙门氏菌检测上游引物F2浓度为0.28 μM ‑0.85 μM； 所述沙 门氏菌检测下游引物R2浓度为0.28 μM ‑0.85 μM； 所述检测液I I为醋酸镁的溶 液； 其中醋酸镁 浓度为280mM； 所述检测液I II为浓度在10 0×‑10000×之间的SYBR  Green I溶液。 2.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述标准结果对 照品获取方法为： 按照本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤检测沙门氏菌基因组DNA 浓度为10‑3ng/ μL、 10‑4ng/ μL、 10‑5ng/ μL的三个样本以及阴性标准品、 阳性标准品， 检测完成 后得到5个带颜色的核酸检测管， 参照上述核酸检测管结果颜色， 用橙色和绿色染料配制 5 份颜色与之对应一致的染色液， 依次按顺序将 5份配制的染色液加入可密封的P CR 8联排管 的5个管中， 盖上8联排盖子， 在盖子或8联排管的外侧依次标注为10‑3ng/ μL、 10‑4ng/ μL、 10‑ 5ng/ μL、 0、 +， 整体作为标准结果对照品； 所述标准结果对照品中的液体容量为50 μL ‑200 μL， 优选为50 μL； 所述5个带颜色的核酸检测管结果颜色依次分别为绿色、 黄绿色、 浅黄绿色、 橙红色、 绿 色； 所述本发明检测待测样本中的沙门氏菌的步骤为： (1)待测样本核酸提取； (2)配制本 发明的待测样本的检测体系： 33.5 μL检测液I加入到核酸检测管； 加入12 μL待测核酸； 2.5 μL 检测液II加入到核酸检测管； 将2 μL的检测液III滴加在 核酸检测管的盖子内侧上； (3)盖上 核酸检测管盖子， 将核酸检测管放置35℃ ‑45℃中反应5min ‑25min； (4)结果检测： 将核酸检 测管上下颠倒， 充分混匀核酸检测管中液体； 核酸检测管在室温放置1min ‑5min； 每次检测 反应均同步检测阳性标准品、 阴性标准品各一份； (5)结果判读： 首先检测阳性标准品的核 酸检测管， 比对标准结果对照品， 与标准结果对照品中标注为 “+”的管的颜色一致为绿色， 且检测阴性标准品的核酸检测管比对标准结果对照品， 与标准结果对照品中标注为 “0”的 管的颜色一致为橙红色， 判断本次检测结果可信， 否则结果不可信， 需要重新检测； 检测待 测样本的核酸检测管比对标准结果对照品， 颜色与标注为 “0”的管的颜色一致， 判断为阴 性； 检测待测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为 “+”的管的颜色相近， 判断 为阳性， 同时判断待测核酸浓度 大于10‑3ng/ μL； 检测待测样本的核酸检测管颜色与 标准结 果对照品中标注为 “10‑4ng/ μL”的管的颜色相近， 判断待测核酸浓度接近10‑4ng/ μL； 检测待 测样本的核酸检测管颜色与标准结果对照品中标注为 “10‑5ng/ μL”的管的颜色相近判断待 测核酸浓度接 近10‑5ng/ μL；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114606329 A 2所述步骤(1)待测样本核酸提取的具体操作为： 1)待测样本为液体时每份样本取100μ L‑500 μL， 待测样 本为胶状或膏状或半固体状或固体时， 每份待测样 本取100mg ‑500mg， 充分 剪碎； 2)所述待测样本加入核酸提取管， 充分混匀； 3)核酸提取管放置90℃ ‑100℃孵育 5min‑25min； 4)将核酸提取管 12000g离心， 1min ‑5min， 保留上清液， 上清液即为提取得到的 待测核酸。 3.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 本发明的待测样 本核酸提取步骤的1)中， 优选的， 所述待测样本的取样量与核酸提取管内的核酸提取试剂 的用量相同； 更优选的， 所述核酸提取管中装有200 μL的核酸提取试剂； 更优选的， 所述待测 样本为液体时每份样本取200 μL， 待测样 本为胶状或膏状或半固体状或固体时， 每份待测样 本取200mg。 4.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 待测样本核酸提 取步骤3)中， 更优选的， 100℃孵育10min； 待测样本核酸提取步骤4)中， 更优选的， 12000g离 心3min。 5.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述本发明检测 待测样本中的沙门氏菌的步骤(3)中更优选的温度为35℃； 其中， 优选的反应时间为5min ‑ 20min。 6.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 更优选的反应时 间为10mi n。 7.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述阳性标准品 获取方法： 按照通用细菌基因组DNA提取试剂盒操作提取沙门氏菌标准菌株基因组DNA， 从 细菌样本中获得DNA， 溶于TE溶液或无菌去离子水中， 检测核酸浓度后， 用TE溶液或无菌去 离子水稀释沙门氏菌标准菌株基因组DNA浓度为10‑2ng/ μL‑100ng/ μL， 更优 选的稀释沙门氏 菌标准菌株 基因组DNA浓度为1ng/ μL。 8.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂 盒， 其特征在于： 所述核酸提取管 中核酸提取试剂为： 0.5mol/L  NaOH、 2％浓度的Chelex ‑100、 0.05mol/L的TrisHCl， 三者以 1:1:1的体积比例配制。 9.根据权利要求1所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒， 其特征在于所述沙门氏菌检 测上游引物F1序列 为:5'‑CGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAG ‑3'(SEQ ID NO1)， 所述沙门 氏菌检测下游引物序列R 1为:5'‑CTGCTACCTTGCTGATG GATTGTTGGATTA‑3'(SEQ ID NO 2)。 10.根据权利要求2所述的沙门氏菌的可视化检测试剂盒， 其特征在于： 所述待测样本 的检测体系优选为50 μL的体系， 体系为： 12 μL提取待测样本后得到的待测核酸、 33.5 μL检测 液I、 2.5 μL检测液II、 2 μL的检测液III； 共50 μL， 所述检测液I为含有0.7μM的沙门氏菌检测 上游引物F2和0.7μM的沙门氏菌检测下游引物R2的RPA通用反应检测液， 检测液III为含有 1000×的SYBR Green I溶液。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114606329 A 3