(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210433499.X (22)申请日 2022.04.24 (71)申请人 广西壮族自治区亚热 带作物研究所 （广西亚热 带农产品加工 研究所） 地址 530001 广西壮 族自治区南宁市 兴宁 区邕武路2 2号 (72)发明人 吴凤　张莉娟　李冬桂　王丽萍　 韦璐阳　杨秀娟　邓有展　吴静娜　 李今朝　王运儒　秦玉燕　蒋越华　 时鹏涛　李鸿　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 王颖 (51)Int.Cl. C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试 剂盒及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测冠突散囊菌的 荧光定量PCR试剂盒及其应用， 属于微生物菌种 检测技术领域。 该试剂盒包括上游引物和下游引 物； 所述上游引 物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1 所示； 所述下游引物的核苷酸序列如SEQ  ID  No.2所示。 采用本发明的检测方法相比于其他检 测方法具有明显优势。 传统的微生物学分离培养 存在程序繁琐、 检测周 期长等问题， 但本发明建 立的冠突散囊菌的荧光定量PCR检测方法特异性 好、 灵敏度高、 结果准确， 并且可以很好的区分冠 突散囊菌； 而且该方法操作简单、 快速， 在普通的 分子实验室均可以进行， 在微生物快速检测的市 场背景下， 本发明具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图4页 CN 114774575 A 2022.07.22 CN 114774575 A 1.一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于， 包括上游引物和下游 引物； 所述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示； 所述下游引物的核苷酸序列如SEQ   ID No.2所示。 2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阳性对 照， 所述阳性对照为冠突散囊菌 菌株基因组DNA或是含有SEQ  ID No.3所示序列的载体。 3.根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括阴性对 照标准品。 4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于， 所述阴性对照标准品为无 菌水。 5.一种利用如权利要求1 ‑4任一项所述荧光定量PCR试剂盒检测冠突散囊菌的方法， 其 特征在于， 所述方法为采用实时荧 光定量PCR检测所述冠突散囊菌 。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR的扩增体系为： 2 × Tip Green qPCR SuperMix  10 μL， 10 μM的上下游引物各0.4 μL， 模板DNA  1 μL， 灭 菌去离子水补足至20 μL。 7.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于， 所述实时荧光定量PCR的扩增程序为： 预变 性94℃、 3 0s； 变性94℃、 5s， 退火6 0℃、 15s， 延伸72℃、 10s， 40个 循环。 8.一种如权利要求1 ‑4任一项所述的试剂盒或权利要求5 ‑7任一项所述的方法在检测 冠突散囊菌中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774575 A 2一种用于 检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及 微生物菌种检测技术领域， 特别是涉及一种用于检测冠突散囊菌的荧 光定量PCR试剂盒及其应用。 背景技术 [0002]黑茶是一种后发酵茶， 在特定的温度和湿度条件下， 通过发花工艺生长出 “金花”。 而通过模拟茯砖茶特殊的发花工艺， 普洱茶、 六堡茶、 白茶等茶叶种类都能生长出 “金花”。 金花菌的数量是判断 “金花”样品的重要品质之一。 [0003]目前国内外对 “金花”的研究较少， 研究内容也比较滞后， 主要根据形态学特征鉴 定， 不同研究者将其命名为谢瓦氏曲霉、 冠突曲霉、 针刺曲霉、 灰绿曲霉等， 随着分子生物学 和生理生化技术的发展， 并参考真菌鉴定手册， 大对数研究者们将 “金花”菌确定为冠突散 囊菌， 其无性型为冠突曲霉。 冠突散囊菌数量是衡量茯砖茶 品质的指标之一， 在现行国家标 准GB/T 9833.3‑2013中规定茯砖茶中冠突散囊菌数量需要达 到20×104CFU/g以上。 [0004]目前冠突散囊菌数量的检测仍没有针对性的方法。 冠突散囊菌数量检测使用标准 GB 4789.15‑2016中的方法一： 霉菌与酵母平板计数法。 该检测方法主要依靠选择性培养基 计数和形态学检测， 属于传统的微生物学检测方法， 该方法也存在程序繁琐、 周期长等问 题， 且没有明确冠突散囊菌的形态学特征， 仍需要根据文献资料参考比对鉴定， 不能确保与 其他类似霉菌 完全区分， 可能存在鉴定不 准确等问题。 [0005]因此， 建立一种快速、 敏感、 特异的冠突散囊菌荧光定量PCR方法具有重要的实践 意义。 发明内容 [0006]本发明的目的是提供一种用于检测冠突散囊菌 的荧光定量PCR的试剂盒， 针对现 有标准冠突散囊菌数量检测过程中容易出现的问题， 提供了一种 快速、 特异检测冠突散囊 菌的荧光定量P CR试剂盒及其检测方法， 可以替代传统的平板计数法， 能够 满足大部 分茶厂 对茶叶中冠突散囊菌快速检测的需求， 为食品安全监控提供新的科 学依据。 [0007]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0008]技术方案一： 一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PC R试剂盒， 包括上游引物和下 游引物； 所述上游引物的核苷酸序列如SEQ  ID No.1所示； 所述下游引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.2所示。 [0009]进一步地， 所述试剂盒还包括阳性对照， 所述阳性对照为冠突散囊菌菌株基因组 DNA或是含有SEQ  ID No.3所示序列的载体。 [0010]所述SEQ ID NO:3序列为： [0011]GGCTCGTAGCGTTAGTAGGCCGATGACCGGTCGACTGCCTAGCGGGTCGGGGACTTGCGCGTACCACA TGTAGAGGTAACTA GCGATGACTGTGATGGACATGCGGGCGAA GAGGATCTAACTCGTTA GCCGGGATAAGGTCAT ATTTATAGCAGTGGGCAATACCTGAAA GGGATCCATTCCA GCACCGCGCTCTCCGTCAATCTCGA GATACTGTGTC说　明　书 1/6 页 3 CN 114774575 A 3