(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210445845.6 (22)申请日 2022.04.26 (71)申请人 安徽农业大 学 地址 230036 安徽省合肥市蜀山区长江西 路130号 (72)发明人 吴海强　王勇　王润　谢祥雨　 穆苑苑　刘勋碧　 (74)专利代理 机构 北京东方盛凡知识产权代理 事务所(普通 合伙) 11562 专利代理师 张换君 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测犬细环病毒的引物和TaqMan 探针及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测犬细环病毒的 引物和TaqMan探针及其应用， 属于分子生物学领 域。 所述引物上游 检测引物如SEQ  ID NO:1所示， 下游检测引物如SEQ  ID NO:2所示； 探针如SEQ   ID NO:5所示。 本发明还在上述引物两侧的基因 组序列上， 设计一对新的质粒引物， 其扩增片段 长度为39 5bp， 涵盖了荧光定量引物扩增的178bp 片段的全部， 该对质粒引物的序列如SEQ  ID NO: 3‑4所示。 本发明利用上述引物和探针或者质粒 引物检测犬细环病毒具有检测时间短、 灵敏性 高、 特异性强、 重复性好等优势， 同时也有效的解 决了传统PCR污染问题， 为犬细环病毒的检测提 供了一种有效的技 术手段。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图2页 CN 114622041 A 2022.06.14 CN 114622041 A 1.一种检测犬细环病毒的引物和探针， 其特 征在于， 包括： 上游检测引物： 5' ‑TACCGAAAGTGGCGAAGACC‑3'； 下游检测引物： 5' ‑GCTGCGGGTTCCATTGC‑3'； 探针： 5'‑CGGGGGCACCAAAAGACAATACAT‑3'。 2.如权利要求1所述的引物和探针， 其特征在于， 所述探针的5'端的报告荧光基团为 FAM， 3'端的猝灭荧 光基团为BHQ。 3.一种检测犬细环病毒的质粒引物， 其特征在于， 所述质粒引物能够扩增出包含权利 要求1或者2所述的引物和探针的扩增片段的全部序列， 所述扩增片段如SEQ  ID NO:6所示； 所述质粒引物包括上游质粒引物： 5' ‑TGGAGTCACGGGCTCTGGT ‑3'； 下游质粒引物： 5' ‑ GCCGCATCCTCCGACTAA‑3'。 4.一种检测犬细环病毒的试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求1 ‑2任一项所述的引物和 探针或者权利要求3所述的质粒引物。 5.一种非疾病 诊断目的的检测犬细环病毒的方法， 其特征在于， 包括： 利用权利要求1 ‑ 2任一项所述的引物和探针或者权利要求3所述的质粒引物进 行实时荧光定量反应， 反应结 束后， 将模板DNA的Cq值与标准曲线对照， 得到模板DNA中犬细环病毒目的基因片段拷贝浓 度。 6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 利用所述引物和探针进行实时荧光定量反应 的反应体系包括： 10 μL  2×FastFire  qPCR PreMix， 8 μL  RNase‑Free ddH2O， 1μL的标准质 粒模板， 0.4 μL上游检测引物， 0.4 μL下游检测引物， 0.2 μL  taqman探针； 反应程序为： 94℃180s， 共1个 循环； 94℃5s， 6 0℃30s， 共40个 循环。 7.如权利要求5所述的方法， 其特征在于， 利用所述质粒引物进行实时荧光定量反应的 反应体系包括： 12.5 μL  2×Tap PCR MasterMix， 1μL上游质粒引物， 1μL下游质粒引物， 1μL   DNA样品为模板， 9.5 μL  ddH2O； 反应程序为： 95℃5min， 共1个循环； 95℃30s， 60℃30s， 72℃30s， 共35个循环； 72℃ 10min， 共1个循环； 4℃。 8.如权利要求1 ‑2任一项所述的引物和探针， 或者权利要求3所述的质粒引物在制备检 测犬细环病毒产品中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114622041 A 2一种用于 检测犬细环病毒 的引物和TaqMa n探针及其应用 技术领域 [0001]本发明涉及分子生物学领域， 特别是涉及一种用于检测犬细环病毒的引物和 TaqMan探针及其应用。 背景技术 [0002]细环病毒(Torque  teno virus)属 于指环病毒科， 于1997年在一名日本输血后的 患者体内被检测到， 是一种环状、 单链、 无囊膜、 直径为30～32nm的DNA病毒， 基因组大小为 2.1～3.8kb。 最初被认为是通过输血传播， 后被发现其传播方式多样， 且广泛分布于全世 界。 它具有非常快的突变速率， 使其不同分离株之间的基因组编码蛋白的差异可以达到 47％～70％。 [0003]国际病毒分类委员会将其归为指环病毒科(Anelloviridae)， 并进一步分为甲型 细环病毒属(Alphatorquevirus)、 乙型细环病毒属(Betatorquevirus)、 丙型细环病毒 (Gammatorquevirus)、 丁型细环病毒属(Deltatorquevirus)等10个病 毒属。 其中犬细环病 毒属于辛型细环病毒属(Thetatorquevirus)， 目前致病作用尚不明确， 其在与其他病原体 合并感染中的作用迄今尚未被研究清楚。 因此， 从预防的角度来说， 对于犬细环病毒致病作 用的深入研究和检测方法的建立具有重要的意 义。 [0004]TaqMan实 时荧光定量PCR技术是基于传统PC R技术的基础上， 添加一条具有荧光标 记的核酸杂交探针， 其序列的5'端有一个报告荧光基团， 3'端有一个猝灭荧光基团。 在PCR 过程中， 探针能够特异 性的结合到目标基因上， 由于猝灭荧光基团的作用， 探针并不会对外 释放荧光。 到了PCR延伸阶段， 伴随着聚合酶将探针水解， 报告荧光基团和猝灭荧光基团分 开， 释放出荧光信号， 并被监测系统接收到。 目前虽然有用于犬细小病毒检测的产品， 但是 存在特异 性不高、 灵敏度强、 检测过程复杂、 时间长、 易污染等问题， 不能为检测犬细 小病毒 提供一种有效、 可靠的方法。 发明内容 [0005]本发明的目的是提供一种用于检测犬细环病毒的引物和TaqMan探针及其应用， 以 解决上述现有技术存在的问题， 具有检测时间短、 灵敏性高、 特异 性强、 重复性好等优势， 同 时也有效的解决了传统PCR污染问题， 为犬细环病毒的检测提供了一种有效的技 术手段。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供了如下 方案： [0007]本发明提供一种检测犬细环病毒的引物和探针， 包括： [0008]上游检测引物： 5' ‑TACCGAAAGTGGCGAAGACC‑3'； [0009]下游检测引物： 5' ‑GCTGCGGGTTCCATTGC‑3'； [0010]探针： 5'‑CGGGGGCACCAAAAGACAATACAT‑3'。 [0011]上述引物不仅适用于犬细环病毒的实时荧光定量PC R检测， 还适用于传统PCR的检 测， 其检测对象为犬细环病毒的ORF1基因。 若以待检样 品提取的DNA为模板， 经过引物的引 导进行扩增， 得到的扩增产物的片段长度为178bp， 则表明样品中含有 犬细环病毒。说　明　书 1/6 页 3 CN 114622041 A 3