(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210464598.4 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 苏州天隆生物科技有限公司 地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区 金鸡湖大道99 号纳米城西北区7栋501 室 (72)发明人 李政　王小舟　张扬　王雨　 (74)专利代理 机构 成都九鼎天元知识产权代理 有限公司 51214 专利代理师 胡东东 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种用于检测运动神经元基因突变的引物、 试剂盒及分析方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于检测运动神经元基 因突变的引物、 试剂盒及分析方法， 包括SMN1 ‑ SNP五个突变位点的引物对， 所述五个突变位点 的引物对分别为c.863G＞T引物对、 c.400G＞A引 物对、 c.689C＞T引物对、 c.683T＞A引物对、 c.22dupA引物对。 本发明通过设计ARMS ‑PCR引 物， 建立惰性的PCR扩增反应体系， 可以有效实现 突变体能进行PCR扩增， 而野生型不能扩增， 然后 通过设计不同突变体扩增子Tm值与对应内参基 因扩增子Tm值进行差值计算， 得到ΔTm值， 通过 ΔTm值的大小即可实现SMN1基因不同突变位点 的检测， 通过该方法可以显著缩短因采用巢式 PCR后经一代测序检测突变位点的周期和避免繁 琐的检测流 程。 权利要求书2页 说明书14页 附图3页 CN 114836524 A 2022.08.02 CN 114836524 A 1.一种用于检测运动神经元基因突变的引物， 其特征在于， 包括SMN1 ‑SNP五个突变位 点的引物对， 所述五个突变位点的引物对分别为c.863G＞T引物对、 c.400G＞A引物对、 c.689C＞T引物对、 c.683T＞A引物对和c.2 2dupA引物对。 2.如权利要求1所述的用于检测运动神经元基因突变的引物， 其特征在于， 所述引物对 按照对扩增 后使产生的扩增子进 行熔解时， 不同突变位点的扩增子具有不同的Tm值进行配 置。 3.如权利要求1所述的用于检测运动神经元基因突变的引物， 其特征在于， 所述引物对 按照对扩增 后使产生的扩增子进 行熔解时， 任意两个突变位点的扩增子之 间的Tm值差异 不 小于1.5℃进行配置 。 4.如权利要求1所述的用于检测运动神经元基因突变的引物， 其特征在于， 所述引物对 中不包含与所述五个突变位 点的引物对相对应的野生型引物对。 5.如权利要求1 ‑4任一所述的用于检测运动神经元基因突变的引物， 其特征在于， 所述 c.863G＞T引 物对包含序列为SEQ  ID NO： 13的正向引物和序列为SEQ  ID NO： 14的反向引 物； 所述c.400G＞A引物对包含序列为SEQ  ID NO： 9的正向引物和序列为SEQ  ID NO： 10的反 向引物； 所述c.689C＞T引物对包含序列为SEQ  ID NO： 17的正向引物和序列为SEQ  ID NO： 18的反向引物； 所述c.683T＞A引物对包含序列为SEQ  ID NO： 15的正向引物和序列为SEQ   ID NO： 16的反 向引物； 所述c.22dupA引物对， 包含序列为SEQ  ID NO： 11的正向引物和序列 为SEQ ID NO： 12的反向引物。 6.一种试剂盒， 其特征在于， 包括SMN1 ‑SNP突变位点主反应液， 所述突变位点主反应液 中包含上述权利要求1 ‑5任一所述的用于检测运动神经 元基因突变的引物。 7.如权利 要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述突变位点主反应液中还包含35～50mM   Tris、 2.5～3.0mM  MgCl2、 300～500mg/L  BSA、 2～5％DMSO、 100～200μM  dNTPs、 20～50 × Syto 9染料、 纯化水。 8.如权利要求6所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒中还包含SMN1 ‑7主反应液、 SMN1‑8主反应液， SMN1酶混合液、 0拷贝数质控品、 SMN1 ‑7单拷贝质控品、 SMN1 ‑7两拷贝标准 品、 SMN1‑8单拷贝质控品、 SMN1 ‑8两拷贝标准品、 SMN1 ‑SNP突变型对照品及SMN1 ‑SNP野生型 对照品。 9.如权利要求6所述的试剂 盒， 其特征在于， 在所述用于检测运动神经元基因突变的引 物中， 五个突变位 点的引物对的浓度为5 0‑100nM。 10.如权利 要求6‑9任一所述的试剂盒， 其特征在于， 所述c.863G＞T引物对浓度 为75～ 100nM， 所述c.400G＞A引物对浓度为50～75nM， 所述c.689 C＞T引物对浓度为75～100nM， 所 述c.683T＞A引物对 浓度为50～75nM， 所述c.2 2dupA引物对 浓度为75～10 0nM。 11.一种分析方法， 其特征在于， 向上述权利要求6 ‑10任一所述的试剂盒中加入待分析 对象， 执行特定循环数量或者预定时间的扩增循环， 形成扩增子， 熔解完成扩增后的扩增 子， 获取扩增子在熔解过程中的Tm值， 利用所述Tm值识别不同位 点的基因型。 12.如权利要求11所述的分析方法， 其特征在于， 当所述五个突变位点中， 任一位点所 获得的Tm值 为接近或等于 0时， 判定该分析对象的对应位 点的基因型为野生型。 13.如权利要求11或12所述的分析方法， 其特征在于， 当所述五个突变位点中， 任一位 点所获得的Tm值落入该突变位点引物对所配置的不同的Tm值范围内时， 判定该分析对象的权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114836524 A 2对应位点的基因型为 突变型。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114836524 A 3