(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210467094.8 (22)申请日 2022.04.29 (71)申请人 苏州大学 地址 215000 江苏省苏州市吴中区石湖西 路188号 (72)发明人 彭浩　姚佳玲　刘洋　 (74)专利代理 机构 苏州市中南伟业知识产权代 理事务所(普通 合伙) 32257 专利代理师 王玉仙 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) C12Q 1/6858(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化 标志物及试剂盒 (57)摘要 本发明涉及一种预测缺血性脑卒中发病风 险的DNA羟甲基化标志物及试剂盒， DNA羟甲基化 标志物包括NPPA 基因启动子区的DNA羟甲基化位 点Chr1:11908348， 其羟甲基化程度指示缺血性 脑卒中发病风险程度。 本发明提供的NPPA基因 DNA羟甲基化标志物可用于 预测缺血性脑 卒中发 病风险， 也可以作为预防和控制缺血性脑卒中的 干预靶点， 不仅有助于阐释心房利钠肽作用于缺 血性脑卒中的分子机制， 也将为NPPA 基因羟甲基 化作为预防和控制缺血性脑卒中的药物靶点提 供重要的流行病学证据。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 114774536 A 2022.07.22 CN 114774536 A 1.一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲基化标志物， 其特征在于： 所述DNA羟甲 基化标志物包括NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点Chr1:11908348， 其羟甲基化程度指 示缺血性脑卒中发病风险程度。 2.根据权利要求1所述的DNA羟甲基化标志物， 其特征在于： 所述DNA羟甲基化位点 Chr1:11908348的羟甲基化水平每增 加2倍， 缺血性脑卒中的发病风险升高39％。 3.根据权利 要求1所述的DNA羟甲基化标志物， 其特征在于： 扩增所述DNA羟甲基化标志 物的上游引物如SEQ  ID NO.1所示， 下游引物如SEQ  ID NO.2所示。 4.根据权利 要求1所述的DNA羟甲基化标志物， 其特征在于， 检测所述DNA羟甲基化标志 物的羟甲基化水平包括以下步骤： (1)提取DNA样本， 用T4β ‑葡糖基转移酶和APOBE C3A酶处理所述DNA样本； (2)扩增步骤(1)处 理后的DNA样本， 得到扩增产物； (3)对步骤(2)的扩增产物进行转录和酶切， 得到转录和酶切产物； (4)对步骤(3)的转录和酶切产物进行检测， 获取序列中Chr1:11908348位点 的羟甲基 化程度。 5.权利要求1 ‑4任一项所述的DNA羟甲基化标志物在制备预测缺血性脑卒中发病风险 的试剂盒中的应用。 6.根据权利要求5所述的应用， 其特征在于： 所述试剂 盒中还包括扩增NPPA基因启动子 区的DNA羟甲基化 位点Chr1:11908348的引物。 7.扩增权利要求1 ‑4任一项所述的DNA羟甲基化标志物的引物在制备预测缺血性脑卒 中发病风险的试剂盒中的应用。 8.权利要求1 ‑4任一项所述的DNA羟甲基化标志物在制备缺血性脑卒中治疗药物中的 应用， 其特征在于： 所述缺血性脑卒中治疗药物以NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化位点 Chr1:11908348为靶点进行设计， 抑制其羟甲基化水平。 9.一种预测缺血性脑卒中发病风险的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中包括扩增 NPPA基因启动子区的DNA羟甲基化 位点Chr1:11908348的引物。 10.根据权利要求9所述的试剂盒， 其特征在于： 所述试剂盒中还包括检测所述NPPA基 因启动子区的DNA羟甲基化 位点Chr1:11908348羟甲基化水平的试剂。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114774536 A 2预测缺血性脑卒中发病风险的DNA羟甲 基化标志物及 试剂盒 技术领域 [0001]本发明涉及生物医药技术领域， 尤其涉及一种预测缺血性脑卒中发病风险的DNA 羟甲基化标志 物及试剂盒。 背景技术 [0002]近年来虽然我国在心脑血管疾病的预防和治疗方面已取得一定的成绩， 但脑卒中 发病率、 患病率、 复发率和死亡率仍然居高不下， 是我国居民死亡和残疾的首要原因， 且随 着社会老龄化和城市化进程加速， 居民不健康生活方式流行， 心脑血管疾病危险因素普遍 暴露， 我国脑卒中疾病 未来有爆发式增长的态势。 脑卒中主要可以分为缺血性脑卒中和出 血性卒中两类， 我国脑卒中主要以缺血性脑卒中为主， 约占脑 卒中总数的70％～8 0％。 据全 球疾病负担研究(GBD)数据显示， 我国缺血性脑卒中的患病率由2010年的1100/10  万上升 至2019年的1256/10万， 出血性卒中的患病率由2010年的232/10  万下降至215/10万， 脑卒 中患病率总体呈上升趋势。 另外， 《中国卒中报告2019》 显示我国每5位死者中至少 有1人死 于脑卒中， 带病生存的脑卒中患者在我国已多达1300万。 因此， 如何有效地预防和控制脑 卒 中主要的类型(缺血性脑卒中)， 寻找并发现更多缺血性脑 卒中的潜在危险因素和干预靶点 迫在眉睫。 [0003]利钠肽轴是机体应对外界环境刺激的重要的心脏内分泌调节系统， 在维持机体水 钠平衡、 血压稳定和能量代谢平衡方面发挥着重要作用。 利钠肽轴主要由心房钠尿肽 (ANP)、 脑钠尿肽(BNP)、 C型钠尿肽(CNP)以及他们的受体构成。 当血容量增加时， 心肌细胞 就会分泌并释放大量的无生物活性的心房钠尿肽前体(pro ‑ANP)和脑钠尿肽前体(pro ‑ BNP)， pro ‑ANP、 pro‑NNP进一步活化为有活性的ANP和BNP， 并与其受体结合激活利钠肽轴， 进而促进 水钠代谢、 降低血容量、 扩张血管、 促进能量代谢， 从而维持心血管稳态。 作为利 钠 肽轴的重要组成之一， A NP可能在缺血性脑 卒中的发生 发展过程中扮演 重要角色， 已有 大量 流行病学证据支持这一假设， 例如，  ANP的编码基因NPPA的基因多态性与高血压、 脑卒中、 心肌梗死和冠心病的人群易 感性显著相关； 人工合 成的ANP(重组卡培立肽、 缬沙坦)已经被 用来治疗急性心衰， 但会引起低血压和血管性水肿等不良结局。 可见， 合成ANP作为药物可 能存在较大隐患， 更好的理解A NP参与缺血性脑卒中的作用机理将有助于针对A NP的药物研 发， 促进ANP的相关研究结果向临床转化。 但是， 尚未见关于NPPA基因DNA羟甲基化与缺血性 脑卒中的研究报道， 也没有报道一种合适的羟甲基化标志物可作为缺血性脑卒中的干预靶 点。 发明内容 [0004]为解决上述技术问题， 本发明通过对NPPA基因DNA羟甲基化与缺血性脑卒中相关 性的研究， 提供了一种与缺血性脑 卒中相关的DNA羟甲基化标志物， 其羟甲基化程度指示缺 血性脑卒中发病风险， 有助于阐释心房利钠肽作用于缺血性脑卒中的分子机制， 且羟 甲基 化水平每增 加2倍， 缺血性脑卒中的发病风险升高39％， 检测灵敏度高。说　明　书 1/6 页 3 CN 114774536 A 3