(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210505270.2 (22)申请日 2022.05.10 (71)申请人 贵州省烟草科学研究院 地址 550081 贵州省贵阳市观山湖区龙 滩 坝路29号 (72)发明人 余婧　赵会纳　雷波　王兵　 郭玉双　贾蒙骜　 (74)专利代理 机构 北京金智普华知识产权代理 有限公司 1 1401 专利代理师 张晓博 (51)Int.Cl. C12N 15/113(2010.01) C12N 15/11(2006.01) C12N 15/56(2006.01) C12N 15/84(2006.01)A01H 5/12(2018.01) A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称 烟草腺毛启动子pNtG GPPS2a及其应用 (57)摘要 本申请公开了烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a 及其应用。 该启动子具有如SEQ  ID NO.1所示的 核苷酸序列， 或与 SEQ ID NO.1限定的DNA序列具 有90％以上同源性、 且 具有相同的启动子活性的 序列。 所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛 组织特异表达， 而不会在叶片非腺毛组织中表 达， 避免了叶片中大量产生次生代谢物而对植株 生长发育造成影 响。 本申请为利用烟草腺毛高效 生产次生代谢物或为高香气烟草品种选育提供 新的调控序列。 权利要求书1页 说明书7页 序列表2页 附图3页 CN 114672489 A 2022.06.28 CN 114672489 A 1.一种烟草腺毛启动 子pNtGGPPS2a， 所述启动子驱动目的基因在烟草叶片腺毛组织特 异表达， 所述启动子核苷酸序列为(I)或(I I)的一种： (I)如SEQ ID NO.1所示； (II)与SEQ  ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性， 且具有相同的启动子活性的 序列。 2.扩增权利要求1所述启动子 的引物对， 其中所述引 物对的序列如SEQ  ID NO.2和SEQ   ID NO.3所示。 3.权利要求1所述启动子的制备 方法， 其制备 方法如下： 提取烟草基因 组DNA； 从基因组DNA中克隆启动子pNtG GPPS2a； 启动子pNtG GPPS2a进行顺式作用元件分析； 构建pCAMBIA1391Z ‑pNtGGPPS2a::GUS植物 表达载体； 培养烟草无菌苗， 并将pCAMBIA1391Z ‑pNtGGPPS2a::GUS载体遗传转化至烟草无菌苗 中， 获得转基因烟草； 对转基因烟草进行GUS染色； qRT‑PCR检测NtG GPPS2a基因在 烟草腺毛中的相对表达情况。 4.根据权利要求3的制备方法， 其中遗传转化过程是通过农杆菌介导将重组质粒转化 至烟草中。 5.权利要求1的启动子在 烟草基因工程育种的应用， 具体为： 所述启动子驱动目的基因在烟草腺毛部位表达， 高效生产次生代谢物以及定向培育 高 香气烟草 新品种。 6.一种核酸分子， 其包 含权利要求1所述启动子的序列。 7.包含权利要求6所述核酸分子的嵌合基因， 其中所述核酸分子嵌合连接至异源核酸 分子。 8.根据权利要求7的嵌合基因， 其中所述异源核酸分子编码蛋白或肽。 9.包含权利要求6所述核酸分子的载体。 10.包含权利要求9所述载体的宿主细胞。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114672489 A 2烟草腺毛启动子pNtG GPPS2a及其应用 技术领域 [0001]本申请涉及植物基因工程技术领域， 尤其涉及烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a及其应 用。 背景技术 [0002]腺毛是植物表皮细胞分化形成的特殊结构。 腺毛能合成、 储存和 分泌一系列次生 代谢物(如生物碱、 尼古丁和萜烯 等)来保护植物免受食草动物和昆虫的侵害， 此外， 腺毛 又 被称为代谢物合成的 “小型工厂 ”， 一些特殊的代谢物已成为具有重要商业价值的杀虫剂、 食品添加剂、 香料或药物成分等， 如黄花蒿(Artemisia  annua)中的青蒿素、 薄荷(Mentha   spicata)中的薄荷醇、 大麻(Cannabis  sativa)中的大麻素等代谢物都主要在腺毛中合成 和储存。 [0003]烟草(Nicotiana  tabacum L.)是一种重要的经济作 物， 烟草腺毛分泌物主要为西 柏烷二萜、 糖酯、 烷烃以及挥发性的醛、 酮、 酸等组成的混合物， 约占鲜烟叶重的0.5～10％， 其中大部分成分对烟叶香气有重要贡献。 研究表明， 西柏 烷二萜合成途径中的二个关键酶 基因CBTS、 C YP71D16均在腺毛中特异 表达。 [0004]启动子是位于基因5'端上游的一段DNA序列， 它能被RNA聚合酶识别并结合， 调控 目的基因在特定的时间或空间表达 。 [0005]来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S是目前植物基因工程中常用的组成性表达启动 子， 它可驱动目的基因在植物的任何发育阶段及组织部位中表达， 但如果应用于生产次生 代谢物时， 这种组成性表达往往会使目的产物在整个植物体内积累， 从而使植物生长出现 异常。 发明内容 [0006]现有技术中， 常选用来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S作为植物基因工程中组成性 表达启动子， 如上所述， CaMV35S启动子用于植物体内生产次生代谢物时， 表达往往会使目 的产物在整个植物体内积累， 从而使植物生长出现异常， 因而不利于提高烟草腺毛分泌产 生对烟叶香气有重要作用的成份。 [0007]有鉴于此， 腺毛组织特异性启动子能驱动目的基因在腺毛中特异表达， 有效避免 了外源基因表达(或 内源基因过表达)时， 对植物生长发育造成危害。 因此， 本申请构思在于 提供一种烟草腺毛启动子， 所述启动子驱动目的基因在 烟草腺毛的特异 表达。 [0008]第一方面， 本申请实施例公开了一种烟草腺毛启动子pNtGGPPS2a， 所述启动子驱 动目的基因在 烟草叶片腺毛组织特异 表达， 所述启动子核苷酸序列为(I)或(I I)的一种： [0009](I)如SEQ ID NO.1所示； [0010](II)与SEQ  ID NO.1限定的DNA序列具有90％以上同源性， 且具有相同的启动子活 性的序列。 [0011]第二方面， 本申请实施例提供了扩增第一方面所述启动子 的引物对， 所述引 物对说　明　书 1/7 页 3 CN 114672489 A 3