(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210548632.6 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 华南师范大学 地址 510631 广东省广州市天河区中山大 道西55号华南师范大学 (72)发明人 周小明　林梅　 (74)专利代理 机构 广州市华学知识产权代理有 限公司 4 4245 专利代理师 郭炜绵 (51)Int.Cl. C12Q 1/6844(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称 一种添加剂辅助的一管核酸检测方法 (57)摘要 本发明公开了一种添加剂辅助的一管核酸 检测方法， 该方法包括以下步骤： 将核酸检测反 应液加入反应管底， 将核酸扩增反应液加入同一 反应管的管壁， 短暂离心使管壁上的反应液下沉 与管底反应液接触 混合， 检测反应管中的荧光信 号； 所述的核酸检测反应液中含有甘油， 甘油占 反应体系的体积百分比为10 ‑20％。 相对于分步 反应体系， 本发 明的检测方法达到相同的检测灵 敏度， 同时又避免了气溶胶污染的产生， 简化了 实验步骤。 相对于基于物理分离的一管反应体 系， 本发明的检测方法简化了实验操作步骤。 相 对优化Cas反应体系， 本发明的检测方法仅用一 条引导RNA即可实现高灵敏度的核酸检测， 简化 了反应体系。 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 CN 114908144 A 2022.08.16 CN 114908144 A 1.一管核酸检测方法， 其特 征在于包括以下步骤： 将核酸检测反应液加入反应管底， 将核酸扩增反应液加入 同一反应管的管壁， 短暂离 心使管壁上的反应液 下沉与管底反应液接触混合， 孵 育并检测反应管中的荧 光信号； 所述的核酸检测反应液中含有甘油， 甘油占反应体系的体积百分比为10 ‑20％； 所述的 反应体系包括核酸检测反应液和核酸扩增反应液。 2.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述甘油占反应体系的体积 百分比为15％。 3.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述核酸检测反应液与核酸 扩增反应液的体积比为1:(0.1 ‑10)。 4.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述孵育是在温度25 ‑65℃ 下进行。 5.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述的核酸检测反应液中含 有荧光报告探针、 crRNA、 Cas蛋白和反应缓冲液。 6.根据权利要求5所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述的核酸检测反应液中， 荧光报告探针的终浓度为20 0nM‑1uM。 7.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述核酸扩增反应液包括扩 增引物、 扩增所需的蛋白酶、 扩增缓冲液， 和包 含靶标核酸的待测物。 8.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述的核酸扩增反应液是以 下核酸扩增类型的反应 体系： 重组酶聚合酶等温扩增(RPA)、 依赖核酸序列扩增(NASBA)、 重组酶介导等温核酸扩增 (RAA)、 转录介导的扩增(TMA)、 依赖解旋酶恒 温扩增(HDA)、 链置换扩增(SDA)、 环介导等温 扩增(LAMP)、 嵌合体置换反应(RDC)、 核酸等温嵌合扩增(ICAN)、 线性等温聚合扩增(LIMA)、 智能扩增过程(SMAP)、 双引物等温扩增(DAMP)、 自我延伸扩增(SEA)、 滚环扩增(RCA)、 指数 等温扩增(EXPAR)或单引物等温扩增技 术(SPIA)。 9.根据权利要求8所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述重组酶聚合酶等温扩增 的反应体系包括单链DNA结合蛋白(S SB)、 重组酶和链置换聚合酶。 10.根据权利要求1所述的一管核酸检测方法， 其特征在于： 所述核酸检测反应液是以 下检测系统的反应 体系： V型CRISPR/Cas检测系统、 生物发光检测系统、 比色检测系统或电化学检测系统。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114908144 A 2一种添加剂辅助的一管核酸检测方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物检测领域， 具体涉及一种添加剂辅助的一管核酸检测方法。 背景技术 [0002]目前， CRISPR/Cas系统， 如CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13系统， 因其特异性、 可编 程性和易用性等优点已被广泛地应用于核酸检测领域。 然而， 单独的CRISPR ‑Cas检测体系 灵敏度仍难以满足临床的分析要求。 因此目前基于CRISPR/Cas技术的核酸检测方法绝大多 数是与核酸扩增技 术相结合的。 [0003]在基于核酸扩增与CRISPR/Cas系统的一管核酸检测方法中， 由于CRISPR/Cas体系 能识别并降解扩增靶标， 导致扩增模板缺失， 所以扩增效率大大降低。 此外， 被靶标核酸激 活的CRISPR/Cas系统能够非特异地降解核酸扩增所需的引物， 进而导致扩增效率下降。 这 些因素导致现有的基于核酸扩增与CRISPR/Cas技术相结合的一管方法检测效率低下， 不能 满足高灵敏的核酸检测要求。 [0004]为了解决上述问题， 很多研究将CRISPR/Cas检测与核酸扩增两个过程分开进行， 尽管能实现灵敏度的提升但其检测程序涉及到扩增产 物的转移， 这容易造成气溶胶污染进 而导致假阳性的检测结果。 发明内容 [0005]为了克服现有技术的缺陷， 本发明的目的在于提供一种添加剂辅助的一管核酸检 测方法。 [0006]本发明的目的通过 下述技术方案实现： [0007]一管核酸检测方法， 包括以下步骤： [0008]将核酸检测 反应液加入反应管底， 将核酸扩增反应液加入同一反应管的管壁， 短 暂离心使管壁上 的反应液下沉与管底反应液接触混合(接触后逐渐混合， 未混匀)， 孵育并 检测反应管中的荧 光信号； [0009]所述的核酸检测反应液中含有甘油， 甘油占反应体系的体积百分比为10 ‑20％， 优 选15％； 所述的反应 体系包括核酸检测反应液和核酸扩增反应液； [0010]所述的核酸检测反应液中含有荧光报告探针， 其终浓度为200nM ‑1uM， 以保证靶标 核酸附近存在充足的荧 光报告探针可被切割； [0011]所述的核酸检测反应液中还含有终浓度10 ‑500nM的crRNA、 终浓度10 ‑500nM的Cas 蛋白和反应缓冲液； [0012]所述核酸检测反应液与核酸扩增反应液的体积比为1:(0.1 ‑10)； [0013]所述孵育是在温度25 ‑65℃下进行； [0014]所述核酸扩增反应液包括终浓度120 ‑480nM的扩增引物、 扩增所需的蛋白酶、 扩增 缓冲液， 和包 含靶标核酸的待测物； [0015]所述的核酸扩增反应液 可以是以下核酸扩增类型的反应 体系：说　明　书 1/5 页 3 CN 114908144 A 3