(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210553474.3 (22)申请日 2022.05.20 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 王小红　郑然静　丁一峰　黄晨曦　 王佳　邵彦春　王源上　 (74)专利代理 机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 专利代理师 冯超 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6851(2018.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR 快速检测试剂盒及其方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种基于噬菌体生物扩增双 重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒及其方法和 应用， 所述试剂盒包括特异性检测肠炎沙门氏菌 噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311 的引物和探针。 本发明公开的噬菌体生物扩增法 结合双重实时荧光定量PCR同时检测沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌的方法及其试剂盒可特异性检 测活的沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌， 检测限均低 至101CFU/mL， 并且可以区分死活菌。 与传统培养 法相比， 检测时间大大缩短， 4h内完成样品的检 测。 权利要求书2页 说明书12页 序列表2页 附图3页 CN 114941041 A 2022.08.26 CN 114941041 A 1.一种基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂 盒， 其特征在于： 所述 试剂盒包括特异性检测肠炎沙门氏菌 噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的引 物和探针， 具体序列如下： SEP37‑F： 5’ ‑TCCGTACCTTGGCAGAAACTT‑3’； SEP37‑R： 5’ ‑GTACGGTCACCAGCTAAGTTGA‑3’； SEP37‑Probe： 5’ ‑FAM‑AAGCTGCTC CAATGCCCGCTGGTATCG‑BHQ1‑3’； LSA2311‑F： 5’ ‑TGATAAGACAGGTGAAATGTACCAAGT‑3’； LSA2311‑R： 5’ ‑CCGTTGCCTTTATCATATAGT TCTTTAA‑3’； LSA2311‑Probe： 5’ ‑HEX‑TAAACGCAGAG GAGACGAC CATTACGCAC‑BHQ2‑3’。 2.根据权利要求1所述基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂 盒， 其 特征在于： 所述试剂盒还包括含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液、 含有 金黄色葡 萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液、 阴性对照品、 阳性对照品、 硫酸亚铁铵溶液和柠檬酸 三钠溶液。 3.根据权利要求2所述基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂 盒， 其 特征在于： 所述含有肠炎沙门氏菌噬菌体S EP37的磷酸 缓冲液中肠炎沙门氏菌噬菌体S EP37 效价为107PFU/mL， 所述含有金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的磷酸缓冲液中金黄色葡萄球 菌噬菌体LSA 2311效价为108PFU/mL； 阴性对照品： 灭菌超纯 水； 阳性对照品为肠炎沙门氏菌、 金黄色葡萄球菌， 分别为肠炎沙门氏菌ATCC  13076、 金黄 色葡萄球菌ATC C 25923； 硫酸亚铁铵溶 液浓度为3 0mM； 柠檬酸三钠溶液为20mM 。 4.一种利用权利要求1所述快速检测试剂 盒同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方 法， 其特征在于： 包括以下步骤： 1)双重噬菌体生物扩增法检测 a.将含有肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的磷酸缓冲液和含有金黄色葡萄球菌噬菌体 LSA2311的磷酸缓冲液混合， 得到混合悬液， 然后混合悬液与前处理的待检测样 品混合， 培 养， 得到培养物； b.将培养物与硫酸亚铁铵溶液混合， 并加入LB液体培养基培养； 然后加入柠檬酸三纳 溶液， 得到混合液； c.将混合液离心， 得到上清液， 即为肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄球菌噬菌 体LSA2311的混合子代噬菌体； 2)子代噬菌体的双重实时荧 光定量PCR检测： a.热裂解法提取混合子代噬菌体的DNA， 并保存于 ‑20℃； b.以混合子代噬菌体的DNA为模板， 利用检测肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37和金黄色葡萄 球菌噬菌体LSA2311的两对引物和探针进行实时荧光定量PCR得到PCR产物， 其中， 两对引物 对和探针分别为： SEP37‑F： 5’ ‑TCCGTACCTTGGCAGAAACTT‑3’；权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114941041 A 2SEP37‑R： 5’ ‑GTACGGTCACCAGCTAAGTTGA‑3’； SEP37‑Probe： 5’ ‑FAM‑AAGCTGCTC CAATGCCCGCTGGTATCG‑BHQ1‑3’； LSA2311‑F： 5’ ‑TGATAAGACAGGTGAAATGTACCAAGT‑3’； LSA2311‑R： 5’ ‑CCGTTGCCTTTATCATATAGT TCTTTAA‑3’； LSA2311‑Probe： 5’ ‑HEX‑TAAACGCAGAG GAGACGAC CATTACGCAC‑BHQ2‑3’； c.qPCR产物的Ct值与标准曲线分析得到待检测的样品中是否含有沙门氏菌和金黄色 葡萄球菌并确定 沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的含量。 5.根据权利要求4所述快速检测试剂盒同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法， 其特征在于： 所述步骤1)第a小步中， 培养物是由混合悬液与待检测样 品按体积1:1混合而 成， 混合悬液中， 肠炎沙门氏菌噬菌体SEP37的效价为106PFU/mL， 金黄色葡萄球菌噬菌体 LSA2311的效价为107PFU/mL。 6.根据权利要求4所述联合试剂盒同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法， 其特 征在于： 所述步骤1)第b小步中， 培养物与硫酸亚铁铵溶液的按体积1:1混合， 硫酸亚铁铵 溶 液浓度为3 0mM， 培养温度为37℃， 培 养时间为10mi n； 柠檬酸三钠溶液添加量为100 μL， 柠檬酸 三钠溶液浓度为20mM 。 7.根据权利要求4所述快速检测试剂盒同时检测沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的方法， 其特征在于： 所述 步骤2)第b小步中， 双重qPCR的反应扩增体系如下： qPCR扩增条件： 94℃预处 理3min， 进行40个 循环反应， 每 个循环包括94℃5s， 6 0℃30s。 8.一种权利要求1所述基于噬菌体生物扩增双重实时荧光定量PCR快速检测试剂盒在 食品安全检测中的应用。 9.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于： 所述食品为 生菜或牛奶。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114941041 A 3