ICS11.220 CCS B 41 DB65 新疆维吾尔自治区地方标准 DB 65/T 4527--2022 家畜布鲁氏菌LAMP检测方法 Detection of brucella in livestock by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay 地方标准信息服务平台 2022-10-10发布 2022－12-09实施 新疆维吾尔自治区市场监督管理局 发布 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4527-2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心提出。 本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实施。 本文件起草单位：乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、深圳真瑞生物科技有限公司、新疆畜牧科 学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站、新 疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心等。 本文件主要起草人：陈利苹、施远翔、李岩、易新萍、蔡扩军、李建玲、叶峰、王涛、吴小梅、陈 昊翰、欧秀玲、米吉提、何国林、杨玲、胡玉军、郭海燕、韩海燕、李燕、马晓靖、陈磊、连晓春、陈 懿、李丽、马倩若、贾立敏、陈小海。 本文件实施应用中的疑问，请咨询乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心、深圳真瑞生物科技有限公 司。 对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局（乌鲁木齐市新华南路408号）、 乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心（乌鲁木齐市南湖西路15号）、深圳真瑞生物科技有限公司（广东 省深圳市龙华区龙华街道清宁路1号富安娜工业园B栋5层）、新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科 学院动物临床医学研究中心）（乌鲁木齐市新市区冬融街726号）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总 站（乌鲁木齐市米东区米东南路2188号红光雅居7号公建楼）、新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中 心（乌鲁木齐市新市区蓝天路268号）、新疆维吾尔自治区市场监督管理局（乌鲁木齐市新华南路167号）。 新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话：0991-8568089；传真：0991-8527722；邮编：830004 乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心联系电话：0991-4616369；传真：0991-4668587；邮编：830063 深圳真瑞生物科技有限公司联系电话：0755-26582639；邮编：518100 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）联系电话：0991-3098109； 传真：0991-3098109；邮编：830013 新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站联系电话：0991-4641759；传真：0991-4641759；邮编：830021 新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心联系电话：0991-4625110；传真：0991-4641491；邮编： 830011 新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话：0991-2818750；传真0991-2311250；邮编：830004 理信息服务平台 1 地方标准信息服务平台 DB 65/T 4527-—2022 家畜布鲁氏菌LAMP检测方法 1范围 本文件规定了家畜布鲁氏菌环介导等温核酸扩增技术（LAMP）检测的生物安全措施、仪器耗材与试 剂、操作方法等要求。 本文件适用于新疆维吾尔自治区境内的牛、羊等家畜布鲁氏菌核酸的检测。未免疫布病疫苗的牛羊 或使用布病疫苗免疫后的牛、羊应在接种疫苗后18个月检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 DB65/T3893羊布鲁氏菌病监测样品采集技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4生物安全措施 应由经过实验室生物安全培训并取得检测员上岗证的工作人员进行样本的采集、处理和检测工作， 样本采集和处理时应采取必要的预防气溶胶感染的安全措施，穿一次性防护服，佩戴N95口罩、手套及 护目镜。检测过程产生的废弃物应按照GB19489的规定处理。 标准信息服 5仪器耗材与试剂 5.1仪器 所用仪器如下： a) 恒温振荡仪：智能多温度联动控制，每段程序可定时，最高加热温度≥95℃，振荡频率≥2000 rpm，振荡振幅≥2mm，振荡方式水平回转； 微量移液器（1μ～10μ，20μ～200，200～1000）； c） 掌上离心机：最高转速8000rpm，可定时； d）方 旋涡振荡器； e） 实时荧光恒温扩增仪或荧光定量PCR仪：激发光/检测光波长分别为480/523nm。 5.2耗材 1 DB 65/T 4527-2022 所用耗材如下： a）0.2mL透明顶盖PCR反应管（适配荧光定量PCR仪）或螺帽反应管（适配实时荧光恒温扩增 仪）； b）一次性移液吸头； c）样品保存管（15mL、4mL）； d）点断式植绒拭子； e）冰盒。 5.3试剂 所用试剂如下： a）样本处理管：管内含有释放样本核酸的商品化试剂； b）LAMP反应液：含有布鲁氏菌特异性检测引物的商品化LAMP扩增试剂； c)1 酶混合液：催化LAMP反应进行的商业化酶； d）阳性质控：含有目标核酸片段的质粒制品（商品化试剂）； e)[ 阴性质控：含有无关核酸序列的质粒制品（商品化试剂）。 6操作方法 6.1扩增前准备 设置仪器参数，不同判读方式的试剂对应不同的扩增仪器，参数设置如下： a）恒温震荡仪：S1（样本处理程序）：95℃，转速2000rpm，时间10min；S2（恒温扩增程 序）：65℃，转速0rpm，时间40min; b) 实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪：扩增温度65℃，扩增时间40min，每分钟收集 1次荧光。 6.2样品采集和处理 6.2.1样本的采集 6.2.1.1母畜采集奶液或阴道拭子。每头母畜使用2支～3支点断式植绒拭子，同时塞入阴道内，应 深插拭子，并将拭子在阴道内轻柔转动后取出，将子放入样本保存管中折断，盖严管盖。 6.2.1.2公畜收集尿液或尿道拭子作为检测样本。 6.2.1.3家畜的关节腔积液、流产胎儿的绒毛膜水肿液、流产胎儿的胃内容物也可作为检测样本。 6.2.1.4按照NY/T541和DB65/T3893采集所需布鲁氏菌病检测样品。采集的样本宜当天处理和检 测，若不能当天检测，应暂放于冰箱冷藏室（4℃）保存。 6.2.2样本的前处理 6.2.2.1阴道/尿道拭子：样本保存管中加入生理盐水1mL（此处加液应悬空加入管内，避免样品之 间交叉污染），盖严盖子，涡旋15s，静置5min。小心打开样本保存管盖，用移液器带吸头伸入管底 吸取100μ子涮洗液，加入样本处理管中。 6.2.2.2奶液、尿液：取15mL样本放入样品保存管中，8000rpm离心10min，弃掉上清，用生理盐 水100儿重悬沉淀，转移到样本处理管中。 2 DB65/T4527-—2022 6.2.2.3家畜的关节腔积液、流产胎儿的绒毛膜水肿液或胃内容物，直接取100μ加入样本处理管中。 6.2.2.4采集的样本宜当天处理和检测，样本若需远距离运输，冷藏运输不宜超过24h，若时间过长 宜冷冻保存。 6.2.3扩增模板的制备：将加入了样本液的样本处理管置于恒温震荡仪，运行程序S1：2000rpm，95℃ 振荡10min，程序结束后将样本处理管置于冰盒中冰浴3min。样本处理管冰浴后短暂离心5s，取上 清作为扩增模板。 6.3LAMP方法检测核酸 6.3.1 将LAMP反应液置于室温彻底融化，上下颠倒6次～7次混匀。 6.3.2按照表1配制反应体系。 表1反应体系配制表 反应体系 成分 单个反应 N个检测样本 母液 LAMP反应液 15 μL 15μLXN 酶混合液 1 μL 1 μLXN 模板 样本/阴/阳性对照 4 μL 4 μL/管 密封层 石蜡油 两滴 两滴/管 注：配制反应体系时，先配制好母液分装到各个反应管，再添加模板。 6.3.3配好母液后盖紧离心管盖上下颠倒6次～7次混匀，短暂离心5s后分装，每个反应管分装16μ 母液后，再分别加入4μL的扩增模板，用巴氏吸管加两滴石蜡油封闭反应液，最后将PCR管的管盖盖 严，或是螺帽反应管的螺帽盖拧紧。 6.3.4恒温扩增步骤如下： a）可视法试剂（反应液为紫罗兰色）：将反应管置于恒温震荡仪孔内（放之前确认温度已达到 65℃），运行程序S2，40min反应结束后取出反应管，肉眼观察颜色变化，判读并记录检 测结果； b) 荧光法试剂（反应液为无色透明）：将反应管置于荧光定量PCR仪或实时荧光恒温扩增检测 仪孔内，点击开始键进行反应，40min反应结束后保存并记录检测结果。 标准信 6.4结果判定 6.4.1检测结果成立条件 6.4.1.1可视法试剂：同批反应的阳性对照，反应后溶液颜色由紫罗兰色变成天蓝色；同批反应的阴 性对照，反应后溶液颜色仍为紫罗兰色。 6.4.1.2荧光法试剂：荧光定量PCR仪、实时荧光恒温扩增检测仪或便携式荧光检测仪上读取结果， 同批反应的阴性质控荧光值<阴性阈值标准管荧光值；同批反应的阳性质控荧光值>阳性阈值标准管荧 光值，且有典型的S型扩增曲线 6.4.2样本检测结果判定 3