ICS 65.080 CCS B 10 黑 DB23 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3187—2022 花卉肥用原料纳豆芽孢杆菌菌粉制备技术 规程 2022-05-09 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-06-08 实施 发 布 DB23/T 3187—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省农业标准化技术委员会提出。 本文件起草单位：哈尔滨瑞康源生物科技有限公司、黑龙江省绿色食品科学研究院。 本文件主要起草人：王英男、杨冬、刘丹怡、王英鹏、吴春梅、刘丽、王克红。 I DB23/T 3187—2022 花卉肥用原料纳豆芽孢杆菌菌粉制备技术规程 1 范围 本文件规定了花卉肥用原料纳豆芽孢杆菌菌粉制备的术语和定义、基本要求、原料和设备、制备流 程与方法、保存方法和技术档案。 本文件适用于花卉肥用原料纳豆芽孢杆菌菌粉制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 20287 农用微生物菌剂 NY/T 883 农用微生物菌剂生产技术规程 NY/T 1114 微生物肥料实验用培养基技术条件 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 纳豆芽孢杆菌 纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)是食品纳豆中分离出来的菌种，是枯草芽孢杆菌的一个 亚种，属于一类革兰氏阳性、好氧型、内生抗逆芽孢的杆状细菌。 3.2 纳豆芽孢杆菌菌粉 纳豆芽孢杆菌菌粉指纳豆芽孢杆菌经发酵培养后再加工制成的含有纳豆芽孢杆菌菌体和纳豆芽孢 杆菌发酵产物的粉末状固形物。 4 基本要求 菌种、培养基、发酵环境、条件等应符合NY/T 883的规定。 5 原料和设备 5.1 原料 5.1.1 菌种 纳豆芽孢杆菌菌种来源应符合GB 20287的规定。 1 DB23/T 3187—2022 5.1.2 培养基原料 牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、NaCl、糖蜜、纳豆粉、破壁酵母、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、 水、琼脂。 5.1.3 辅助原料 二氧化硅、保护剂、赋形剂。 5.2 仪器与设备 超净工作台、电热恒温培养箱、恒温震荡器、分析天平、pH测定仪、喷雾干燥机。 6 制备流程与方法 6.1 制备流程 菌种培养→种子液制备→放大发酵→发酵培养→放大发酵→收集菌泥→发酵液的浓缩干燥。 6.2 制备方法 6.2.1 6.2.1.1 菌种培养 培养基制备 菌种培养培养基：牛肉膏 5g/L，蛋白胨 10g/L, NaCl 5g/L,酵母膏 5g/L，葡萄糖 5g/L，琼脂粉 18g/L，pH 7.0，培养基制备方法按照 NY/T 1114 的规定执行。 6.2.1.2 菌种培养方法 菌种培养方法应符合下列规则。 a) 冷冻干燥管的纳豆芽孢杆菌菌种应在无菌环境下操作： 1) 冷冻干燥管表面用 70%酒精擦拭后，在火焰上加热外管尖端，滴数滴无菌水于加热处，使 外管破裂，再以硬棒等敲破尖端； 2) 取出隔热纤维纸和内管，以无菌镊子取出内管之棉塞，用无菌吸管吸取无菌液体培养基 0.3 mL～0.5 mL 滴入管内并轻微震荡（可用该吸管协助），直至菌体冻干粉混匀悬浮。 b) -20°C～-80°C 低温保存的甘油管应进行如下操作： 1) 从低温保存条件取出的纳豆芽孢杆菌甘油管置于 37°C 水浴槽中的管架上，不断轻微摇动 （液面不可高至管塞），直至结冰完全溶解； 2) 上述完全混匀后的菌悬液接种于上述固体斜面培养基上，于 37°C 恒温静置培养 24 h。 c) 4°C 保存的纳豆芽孢杆菌菌体或者菌液可直接转接培养。 6.2.2 6.2.2.1 种子液制备 种子培养基制备 种子培养基：牛肉膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L,葡萄糖 10 g/L，酵母膏 5 g/L，NaCl 5g/L, pH 7.0。 6.2.2.2 种子培养 活化后的菌体接种于种子培养基中，37 ℃恒温震荡（200 r/min）培养 24 h，得到种子液。 2 DB23/T 3187—2022 6.2.3 放大发酵 6.2.3.1 发酵培养基制备 发酵培养基：糖蜜3 g/L～5 g/L，纳豆粉25 g/L～35 g/L，破壁酵母2 g/L～4 g/L，磷酸氢二钠1 g/L～ 1.5 g/L，磷酸二氢钠1 g/L～1.5 g/L，pH调至7.0～7.5，琼脂20 g/L～32 g/L。 6.2.3.2 发酵培养 得到的液体种子均匀喷在发酵固体平板培养基表面，然后放置于恒温发酵室内37 ℃,24 h,封闭发 酵培养。 6.2.4 收集菌泥 固体平板培养基取出发酵室，然后用灭菌后的薄片，将所述固体平板培养基上的菌泥刮下来，收集， 得到菌泥。 6.2.5 发酵液的浓缩干燥 将所述菌泥与水按质量比1:0.5～3混合，得到菌液，再将所述菌液按质量比菌液：二氧化硅＝1:1～ 15添加二氧化硅，进行吸附干燥，过筛，将筛上物进行粉碎后再次过筛，得到菌粉；或将所述菌泥与保 护剂按照质量比1:0.5～2混合后，形成混合液，按所述混合液质量的9％～11％添加赋形剂，再利用喷 雾干燥剂对混合液进行喷雾干燥，喷雾干燥进口温度为120 ℃，出口温度为60 ℃～70 ℃，收集固形物， 得到菌粉。 7 保存方法 放于阴凉干燥处保存为宜。 8 技术档案 应建立制备技术档案，内容包括：原料档案、制备方法档案、保存方法档案等。 3