(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211126760.8 (22)申请日 2022.09.16 (71)申请人 陕西师范大学 地址 710062 陕西省西安市长安 南路199号 (72)发明人 刘永峰　鱼喆喆　雷颖虎　施琳　 付尚辰　赵鹏鹏　 (74)专利代理 机构 西安永生专利代理有限责任 公司 61201 专利代理师 高雪霞 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/34(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳 的方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于DIA标记蛋白鉴定大 熊猫初乳与成熟乳的方法， 该方法采用DIA蛋白 质组学定量 分析技术， 对大熊猫初乳和成熟乳中 蛋白进行定量和定性， 将蛋白质水平在大熊猫初 乳与成熟乳中具有明显差异的蛋白作为标记蛋 白， 从而根据标记蛋白判断其为初乳和成熟乳。 本发明首次鉴定了大熊猫乳汁中的蛋白质， 为筛 选反映大熊猫初乳和成熟乳的标记蛋白提供了 依据， 而且 可以依据蛋白质水平结果判定大熊猫 初乳和成熟乳， 提供了一种新的品质评价方法。 权利要求书2页 说明书5页 附图1页 CN 115480010 A 2022.12.16 CN 115480010 A 1.一种基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特征在于由以下步骤组 成： (1)采集大熊猫初乳样品与成熟乳样品， 分别提取乳中的蛋白； (2)将步骤(1)提取的蛋白混合， 进行肽段酶解， 并以DDA模式质谱分析进行数据采集， 构建谱图库； (3)将步骤(1)提取的蛋白分别进行肽段酶解， 以DIA模式质谱分析进行 数据采集； (4)对步骤(3)中获得的数据采用步骤(2)构建的谱图库进行定性定量分析， 以定性后 的肽段在初乳样品与成熟乳样品中的相对定量值之比的对数值作为判断蛋白丰度水平变 化的依据， 该对 数值大于1.5则为上调蛋白， 该对数值小于2/3则为下调蛋白， 该对 数值处于 1.5和2/3之间则该蛋白丰度在 初乳和成熟乳样品中无显著变化； (5)将步骤(4)获得的初乳样品与成熟乳样品中上调蛋白和下调蛋白按对数值从大到 小排序， 分别取上调蛋白中前5％和下调蛋白中后5％的蛋白作为标记蛋白， 如果标记蛋白 包含正相关的标记蛋白： 含肽酶S1结构域的蛋白质、 排序nexin ‑2蛋白、 EF ‑hand结构域蛋 白、 肽聚糖识别蛋白1， 则 说明待测大熊猫乳样品为初乳； 如果标记蛋白包含负相关的标记 蛋白： ATP ‑柠檬酸裂解酶、 ATP合酶亚基、 谷氨酰胺合成酶、 柠檬酸合成酶、 40S核糖体蛋白 S25、 延伸率Tu、 含硫 氧还蛋白结构域蛋白、 含TGc 结构域蛋白、 Ribo somal_L18e/L15P结构域 蛋白、 Ethylmal onyl‑CoA脱羧酶1， 则说明待大熊猫 乳样品为成熟乳 。 2.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特征在 于： 步骤(1)中， 大熊猫初乳和成熟乳的采集要由专业饲养人员进行， 采集后立即在 ‑76～‑ 80℃冰箱中冷冻保存。 3.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特征在 于： 步骤(2)中， 将步骤(1)提取的蛋白等质量混合。 4.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特征在 于 ： 步 骤 (2) 中 ， 酶 解 后的 肽段 先 在C1 8色 谱 柱上 脱盐 ， 然 后使 用T h e rm o   ScientificTMPierceTM高pH值反相多肽分馏 试剂盒分馏成10个馏分， 每个馏分掺入iRT标准 肽段溶液后， 先采用纳升级高效液相色谱进行梯度在线色谱分离， 色谱柱为C18色谱柱， 流 动相： A液为0.1％甲酸水溶液， B液为0.1％甲酸乙腈水溶液， 其中乙腈水溶液中乙腈体积浓 度为84％； 色谱柱以95％的A液平衡， 流速为300nL/min， 分离梯度如下： 0～40分钟， B液线性 梯度从8％～30％； 40～50分钟， B液线性梯度从30％～100％； 50～65分钟， B液维持100％； 纳升级高效液相色谱分离后用Q ‑Exactive  HFX质谱仪进行DDA质谱分析， 分析时长65分钟， 检测模式正离子， 一级质谱扫描范围300～1800m/z， 质谱分辨率60000@m/z  200， 自动增益 控制目标3e6， 最大注入时间为25ms； 每次一级质谱全扫描后根据包含列表采集20个自动触 发二级扫描， 分离窗口1.6Th， 质谱分辨率15000@m/z  200， 自动增益控制目标5e4， 最大注入 时间为25m s， MS2激活类型H CD， 归一化碰撞能量3 0eV。 5.根据权利要求1或4所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特 征在于： 步骤(2)中， 以DDA模式采集的数据采用Spectronaut软件进行数据处理， 检索参数 设置如下： 酶为胰蛋白酶， 最大漏裂数为 1， 固定修饰为碳酰胺甲基， 动态修饰为氧化和蛋白 质N端乙酰基； 数据库检索鉴定 到的蛋白必须通过设定的过 滤参数FDR<1％。 6.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特征在权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115480010 A 2于： 步骤(3)中， 酶解后的肽段掺入i RT标准肽段溶液后， 采用纳升级高效液相色谱进行梯度 在线色谱分离， 色谱柱 为C18色谱柱， 流动相： A液为0.1％甲酸水溶液， B液为0.1％甲酸乙腈 水溶液， 其中乙腈水溶液中乙腈体积浓度为84％； 色谱柱以95％的A液平衡， 流速为300nL/ min， 分离梯度如下： 0～40分钟， B液线性梯度从8％～30％； 40～50分钟， B液线性梯度从 30％～100％； 50～65分钟， B液维持100％； 纳升级高效液相色谱分离后用Q ‑Exactive  HFX 谱仪进行DIA质谱分析， 检测模式正离子， 一级质谱扫描范围350～1650m/z， 质谱分辨率 60000@m/z  200， 自动增益控制的目标3e6， 最大注入时间为50ms； 二级质谱设置30个DIA采 集窗口， 质谱分辨率30000@m/z  200， 自动增益控制的目标3e6， 最大注入时间为自动， MS2激 活类型HCD， 归一化的碰撞能量3 0eV， 光谱数据类型为轮廓。 7.根据权利要求1所述的基于DIA标记蛋白鉴定大熊猫初乳与成熟乳的方法， 其特征在 于： 步骤(4)中， 以DIA模式采集的数据采用Spectronaut软件进行数据处理， 软件参数设置 如下： 保留时间预测类型设置为动态 iRT， MS2水平校正设置为 允许， 交叉运行规范化设置为 允许， 所有结果必须通过设定的过 滤参数FDR<1％。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115480010 A 3