(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211366715.X (22)申请日 2022.11.03 (71)申请人 北京大学第三医院 （北京大 学第三 临床医学院） 地址 100191 北京市海淀区花园北路49号 (72)发明人 乔杰　李蓉　翟所迪　赵荣生　 杨丽　徐慧玉　张现化　冯国双　 赵立波　韩勇　熊歆　 (74)专利代理 机构 北京彩和律师事务所 1 1688 专利代理师 闫桑田 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/72(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 利用高效液相色谱-离子淌度差分质谱检测 类固醇激素的方法 (57)摘要 本申请涉及一种利用高效液相色谱 ‑离子淌 度差分质谱检测类固醇激素的方法。 其包含对待 检样品进行磁固相萃取原位衍生化及将经原位 衍生化处理的样品注入到高效液相色谱 ‑离子淌 度差分质谱 串联装置中， 以获得质量色谱图。 权利要求书1页 说明书12页 附图10页 CN 115541776 A 2022.12.30 CN 115541776 A 1.一种利用高效液相色谱 ‑离子淌度差分质谱检测类固醇激素的方法， 其包 含： 对待检样品进行衍 生化； 将经衍生化处理的样品注入到高效液相色谱 ‑离子淌度差分质谱串联装置中， 获得质 量色谱图； 其中， 高效液相色谱使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合多孔硅胶柱。 2.根据权利要求1所述的方法， 其中所述色谱柱为核壳型色谱柱。 3.根据权利要求1所述的方法， 其中所述色谱柱为Agi lent Poroshel l 120 EC‑C18。 4.根据权利要求1所述的方法， 其中在所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B 组成的混合流动相进行梯度洗脱， 所述流动相A为甲酸铵或乙酸铵的水溶液， 所述流动相B 为甲醇水 溶液。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其中所述流动相A中甲酸铵的浓度为2mM至10mM； 所述流 动相B中水的含量 为3v%至10v%。 6.根据权利要求2所述的方法， 其中流动相B在所述混合流动相中的体积占比从6:94逐 渐升高至98 :2， 再逐渐减少至 6:94。 7.根据权利要求2的方法， 其中梯度洗脱过程 为： 第一阶段， 流动相B和流动相A的体积比保持6:94； 第二阶段， 流动相B和流动相A的体积比逐渐增 加至为50:50并维持一段时间； 第三阶段， 流动相B和流动相A的体积比逐渐升高至98 :2； 第四阶段， 流动相B和流动相A的体积比逐渐减少至 6:94。 8.根据权利要求1所述的方法， 其中所述 衍生化使用的衍 生剂为肼类或羟胺类化 合物。 9.根据权利要求8所述的方法， 其中所述衍生剂与样品的体积比为80/200至160/200， 所述衍生化的温度是40 至55℃和/或所述 衍生化的时间为 4至6小时。 10.根据权利要求1所述的方法， 其中所述类固醇激素选自： T、 DHEA、 A4、 11OHA4、 11OHT、 11KA4、 17OHP、 1 1KT、 DHT和1 1KDHT。 11.根据权利要求10所述的方法， 其中所述类固醇激素为T、 DHEA、 A4、 11OHA4、 11OHT、 11KA4、 17OHP和1 1KT。 12.根据权利要求1所述的方法， 其中所述样品是包含蛋白质的生物样品， 所述方法还 包含在原位 衍生化之前使所述类固醇激素与所述蛋白质解离 。 13.根据权利要求12所述的方法， 其使用饱和氯化铵缓冲液使类固醇激素与所述蛋白 质解离。 14.根据权利要求12所述的方法， 其中所述 生物样品是 血清。 15.根据权利要求1或12所述的方法， 在衍生化前或使所述类固醇激素与蛋白质解离 后， 还包含使用分散磁性固相萃取技 术吸附所述类固醇激素。 16.根据权利要求15所述的方法， 其使用MGO、 Ni@MWCNT或Fe3O4@SiO2作为吸附剂进行分 散磁固相萃取。 17.根据权利要求16所述的方法， 其中所述吸附剂为MGO， 使用所述吸附剂进行分散磁 固相萃取的吸附时间为20至40分钟和/或所述MGO质量与样品体积的比例为1mg/200μL至 2mg/200 μL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541776 A 2利用高效液相色谱 ‑离子淌度差分质谱检测类固醇 激素的 方法 技术领域 [0001]本申请涉及 一种液相色谱与串联质谱联用的检测方法， 尤其涉及一种对类固醇物 质的高选择性及高准确度的液质联用检测方法。 背景技术 [0002]对人体内类固醇激素含量的准确测量， 对于相关疾病的诊断及治疗有着至关重要 的作用。 例如， 在 多囊卵巢 综合症(PC OS)中， 包括雄激素在内的多种类固醇激素发挥着 重要 作用， 也决定着不同的表型， 治疗重点及临床决策。 [0003]然而， 生化指标的量化需要快速、 稳定和可靠的检测方法。 由于存在 类似结构的化 合物或异构体的内源性干扰物， 基于质谱(MS)的类固醇激素测量通常很复杂， 且检测缺乏 敏感性， 这将影响特异性并可能导 致对结果的误 导。 [0004]此外， 检测前对样品的处理， 也会极大地影响检测的灵敏度及准确性。 然而， 现有 技术中， 通常使用有机溶剂的液 ‑液萃取(LLE)、 固 ‑液相萃取(SLE)和固相萃取 （SPE） 来制备 样品， 包括氯丁烷、 甲基叔丁基醚、 乙酸乙酯和二氯甲烷。 LLE、 SLE及SPE的程序很复杂， 而且 耗费时间。 而且使用大量的有毒有机溶剂会损害操作者的健康， 同时对环境造成污染， 这在 一定程度上阻碍 了质谱法在医学实验室的广泛应用。 发明内容 [0005]为了解决上述技术问题， 提高检测准确性及敏感度， 本申请建立了一种快速、 高选 择性和高灵敏度的高效液相色谱 ‑离子淌度差分质谱检测方法， 并在实施例中实现了对包 括多种11‑氧化雄激素在内的8种类固醇激素的分离及准确定量。 [0006]具体的， 本申请一方面涉及： 1. 一种利用高效液相色谱 ‑离子淌度差分质谱检测或分离类固醇激素的方法， 其 包含： 对待检样品进行分散磁固相萃取原位 衍生化； 将经衍生化处理的样品注入到高效液相色谱 ‑离子淌度差分质谱串联装置中， 获 得质量色谱图。 [0007]在一些实施方案中， 所述质谱是多级质谱， 例如三级、 四级、 五级或更多级质谱。 在 一些实施方案中， 所述质谱是二级质谱。 例如在一些实施方案中， 所述高效液相色谱 ‑离子 淌度差分质谱串联装置是HPLC ‑DMS/MS/MS。 [0008]在一些实施方案中， 所述高效液相色谱使用的色谱柱为十八烷基硅烷键合多孔硅 胶柱。 [0009]2. 根据项1所述的方法， 其中所述色谱柱为核壳型色谱柱。 在一些实施方案中， 所 述色谱柱为任意十八烷基硅烷键合多孔硅胶柱。 在一些实施方案中， 所述十八烷基硅烷键 合多孔硅胶柱选自： Agilent  Poroshell  120 EC‑C18、 Waters  CORTECS C18、 Thermo  说　明　书 1/12 页 3 CN 115541776 A 3