(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211129408.X (22)申请日 2022.09.16 (71)申请人 北大荒完达山乳业股份有限公司 地址 150090 黑龙江省哈尔滨市长江路386 号 申请人 北安完达山乳品有限公司 (72)发明人 杨秀梅　袁兆丰　王丹　王利　 王青云　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市晨晟知识产权代理 有限公司 23219 专利代理师 刘坤 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) (54)发明名称 一种牛乳及其制品中A1β-酪蛋白、 A2β-酪 蛋白的测定方法 (57)摘要 本发明涉及牛乳蛋白领域， 具体公开了一种 牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测 定方法， 所述测定方法包括以下步骤： (1)配制 β‑酪蛋白标准溶液； (2)配制第一试剂、 第二试 剂以及流动相； (3)对奶样进行前处理： 乳品试样 溶解后， 吸取乳品试样加入第一试剂， 混匀静止 后离心处理， 除去表层乳脂， 取底层溶液加入第 二试剂,混匀， 备用； (4)采用液相色谱仪对步骤 (3)前处理完成的乳品试样进行分离， 根据出峰 顺序确定A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白； (5)计算A1 β‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的含量。 本发明解决了 现有技术中的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2 β‑酪蛋白的检测时间长， 难以对A2β ‑酪蛋白做 定量分析的问题。 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 115406996 A 2022.11.29 CN 115406996 A 1.一种牛乳及其制品中A 1β‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征在于， 所述测定方 法包括以下步骤： (1)配制β ‑酪蛋白标准溶 液； (2)配制第一试剂、 第二试剂以及流动相； (3)对奶样进行前处理： 乳品试样溶解后， 吸取乳品试样加入第一试剂， 混匀静止后离 心处理， 除去表层乳 脂， 取底层溶 液加入第二试剂， 混匀， 过 滤膜上机检测备用。 (4)采用液相色谱仪对步骤(3)前处理完成的乳 品试样进行分离， 根据出峰顺序确定A 1 β‑酪蛋白、 A 2β‑酪蛋白； (5)计算A1β ‑酪蛋白、 A 2β‑酪蛋白的含量。 2.根据权利 要求1所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述步骤(1)中配制β ‑酪蛋白标准溶液的操作为： 将β ‑酪蛋白标准物质分成小片絮状 后放入容器中加入水 溶解， 制成β ‑酪蛋白标准溶 液。 3.根据权利 要求1所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述步骤(2)中的第一试剂， 以重量份计包括： 双 ‑三羟甲基氨基甲烷0.2 ‑0.25份； 盐 酸胍5.70 ‑5.80份； 柠檬酸钠0.013 ‑0.015份； 二硫苏糖醇0.025 ‑0.035份。 4.根据权利 要求1所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述 步骤(2)中的第二试剂由盐酸胍， 加三氟乙酸溶 液充分溶解后定容得到 。 5.根据权利 要求1所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述 步骤(2)中的流动相中三氟乙酸溶 液为流动相A， 乙腈 为流动相B。 6.根据权利 要求1所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述步骤(4)中设定液相色谱仪的检测波长214nm， C8色谱柱规格4.6*150mm， 3.6 μm， 柱温50℃ ‑55℃， 流动相A为0.1％三氟乙酸水溶液， 流动相B为乙腈， 梯度洗脱条件 下对标准 品及乳品试样进行检测。 7.根据权利要求1 ‑6任一项所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方 法， 其特征在于， 所述步骤(4)中确定出峰顺序的方式为通过未筛选的奶牛的奶源与经DNA 筛选的A2奶牛的奶源同时检测与β 酪蛋白标准物质进行比较， 确认A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白 的出峰时间和出峰顺序。 8.根据权利 要求7所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述步骤(5)中计算A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白含量的方法为： β ‑酪蛋白标准工作液中 的A1β‑酪蛋白与A2β ‑酪蛋白， 通过面积归一化法计算各自的修正系数， 通过β ‑酪蛋白标准 系列工作液浓度计算的样品中的A1β ‑酪蛋白与A2β ‑酪蛋白在乘以各自的修正系数后， 即为 样品中检测的A1β ‑酪蛋白与A2β ‑酪蛋白浓度， 根据称样质量， 定容体积， 稀释倍数计算样品 中A1β‑酪蛋白与A 2β‑酪蛋白的含量。 9.根据权利 要求8所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特征 在于， 所述第一试剂的溶剂为0.1％三氟乙酸。 10.根据权利要求9所述的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 其特 征在于， 所述 步骤(1)中配制β ‑酪蛋白标准溶 液配制完成后在 ‑20℃保存。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115406996 A 2一种牛乳及其制品中A1 β‑酪蛋白、 A2 β‑酪蛋白的测定方 法 技术领域 [0001]本发明属于牛乳蛋白领域， 尤其涉及一种牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋 白的测定方法。 背景技术 [0002]早期所有家养奶牛只含有A2β ‑酪蛋白， 后因自然基因突变， 出现了A1β ‑酪蛋白的 变体， 经过长期的繁衍， 导致全球奶牛普遍出现了A1型奶牛、 A1A2型奶牛和A2型奶牛。 A1β ‑ 酪蛋白和A2β ‑酪蛋白的蛋白质结构区别主要是第67位的氨基酸不同。 通过消化酶的作用， A1β‑酪蛋白可能产生β ‑酪啡肽‑7(BCM‑7)， 而A2β ‑酪蛋白不会产出或很少产出β ‑酪啡肽‑7 (BCM‑7)。 BCM‑7是一种外啡肽， 可与机体多种系统相互作用。 多项研究表明， A1β ‑酪蛋白或 BCM‑7与部分婴儿的I型糖尿病风险升高， 免疫反应功能性障碍、 消化功能紊乱、 呼吸功能障 碍以及易得自闭症之间存在关联。 另有研 究表明， A2β ‑酪蛋白不仅不会生成BCM ‑7， 而且与 母乳中的β ‑酪蛋白相似， 更有利于促进婴幼儿的生长发育 。 [0003]目前对于A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的检测， 常用的检测方法有快速检测法和仪器 检测法。 [0004]快速检测 法有试剂盒检测 法、 乳品分析仪快速检测 法等。 此类检测方法检测速度 快， 但不能对样品中的A2β ‑酪蛋白做定量分析， 其主要用于对A2β ‑酪蛋白的奶源筛选鉴别， 作为奶源掺假筛查使用的较多。 仪器检测方法有反相高效液相色谱法(RP ‑HPLC)、 等电聚焦 电泳(IEF)法和等位基因特异性聚合酶链 式反应(AS ‑PCR)、 单链构象多态性聚合酶链式反 应(SSCP‑PCR)等， 此类 检测方法能对A 2β‑酪蛋白做定量分析， 但检测时间较长 。 发明内容 [0005]为解决上述现有技术中的牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的检测时间 长， 难以对A2β ‑酪蛋白做定量分析的问题， 本发明提供了一种牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β‑酪蛋白的测定方法。 [0006]本发明的技术方案： 一种牛乳及其制品中A1β ‑酪蛋白、 A2β ‑酪蛋白的测定方法， 所 述测定方法包括以下步骤： [0007](1)配制β ‑酪蛋白标准溶 液； [0008](2)配制第一试剂、 第二试剂以及流动相； [0009](3)对奶样进行前处理： 乳品试样溶解后， 吸取乳品试样加入第一试剂， 混匀静止 后离心处 理， 除去表层乳 脂， 取底层溶 液加入第二试剂， 混匀， 备用； [0010](4)采用液相色谱仪对步骤(3)前处理完成的乳品试样进行分离， 根据出峰顺序确 定A1β‑酪蛋白、 A 2β‑酪蛋白； [0011](5)计算A1β ‑酪蛋白、 A 2β‑酪蛋白的含量。 [0012]所述步骤(1)中配制β ‑酪蛋白标准溶液的操作为： 将β ‑酪蛋白标准物质分成小片 絮状后放入容器中加入水 溶解， 制成β ‑酪蛋白标准溶 液。说　明　书 1/10 页 3 CN 115406996 A 3