(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211181263.8 (22)申请日 2022.09.27 (71)申请人 上海凌凯医药 科技有限公司 地址 201321 上海市浦东 新区康新公路 3399号5号楼 (72)发明人 匡逸　张唐志　陆茜　付杨杰　 甘世凤　闫凤　赵濬宇　 (74)专利代理 机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 2321 1 专利代理师 张勇 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/30(2006.01) G01N 30/34(2006.01)G01N 30/32(2006.01) G01N 30/72(2006.01) (54)发明名称 一种异双官能交联剂的检测方法 (57)摘要 本发明涉及化学分析技术领域， 具体涉及一 种异双官能交联剂的检测方法。 本发 明提供的异 双官能交联剂的检测方法包括如下条件： 液相色 谱检测过程中的流动相A为甲酸和乙腈的混合溶 液， 流动相B为甲酸和水的混合溶液； 流动相洗脱 方式为梯度洗脱， 稀释剂为水。 质谱检测过程中 的碎裂电压为90～115V， 干燥气体流量为10～ 20L/min， 干燥气体温度为300～400℃， 雾化器压 力(30～40)psi。 本发明的异双官能交联剂的检 测方法能够在0.005μg/ml ‑0.5μg/ml的痕量浓 度内， 异双官能交联剂响应值与浓度呈良好的线 性关系， 且检测限可达 5ng/ml。 权利要求书1页 说明书6页 附图5页 CN 115541750 A 2022.12.30 CN 115541750 A 1.一种异双官能交联剂的检测方法， 采用液相色谱 ‑质谱联用技术对异双官能交联剂 进行检测， 所述异双官能交联剂为4 ‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚 胺酯钠盐， 其特 征在于， 包括： A， 液相色谱检测过程中的流动相为流动相A和流动相B， 所述流动相A为第一混合溶液， 所述流动相B为第二混合溶液， 所述第一混合溶液为甲酸和乙腈的混合溶液， 所述第二混合 溶液为甲酸和水的混合溶 液； B， 液相色谱检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱， 洗脱梯度为： 总洗 脱时间分为N步依次进行梯度洗脱， 前N ‑1步梯度中流动相A的比例由(0～10)％渐次升至 (85～95)％， 流动相B的比例由(90～100)％渐次降至(5～15)％， 第N步时流动相A比例为 (85～95)％， 流动相B为(5～15)％， 第N步梯度中流动相A的比例由(85～95)％渐 次降至(0 ～10)％， 流动相B的比例由(5～15)％渐次升 至(90～10 0)％， 且2≤N≤10； 以及 C， 质谱检测过程中的碎裂电压为90～1 15V。 2.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于： 其中， 所述第一混合溶液中， 甲酸与所述乙腈的体积比为(0.25～3):(950～1050)， 所 述第二混合溶 液中， 甲酸与所述水的体积比为(0.25～3):(95 0～1050)。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于： 其中， 梯度洗脱时间为12min， 洗脱梯度 为： 总洗脱时间分为2步依次进行梯度洗脱， 第1 步洗脱时间为0～8min， 0～2min流动相A的比例为5％， 流动相B的比例为95％， 2～8min流动 相A的比例渐次升至90％， 流动相B的比例渐次降至10％， 第2步洗脱时间为8～12min， 8～ 10min流动相A的比例为90％， 流动相B的比例为10％， 10～10.1min流动相A的比例渐次降至 5％， 流动相B的比例渐次升至95％， 10.1～12min流动相A的比例维持5％， 流动相B的比例维 持95％。 4.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于： 其中， 液相色谱 ‑质谱检测过程中采用SIM检测模式下的负离 子模式。 5.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于： 其中， 液相色谱检测过程中的流动相流速为0.1～1.0mL/min； 色谱柱的柱温为25～35 ℃。 6.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于： 其中， 梯度洗脱的时间为10～ 20min。 7.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于： 其中， 液相色谱柱为Phen omenex Kinetex C18色谱柱。 8.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 其中， 质谱检测过程中干燥气体流量为10～20L/min； 所述质谱检测过程中干燥气体温 度为300～400℃。 9.根据权利要求1所述的检测方法， 其特 征在于， 其中， 质谱检测过程中雾化器压力(3 0～40)psi。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115541750 A 2一种异双官能交联剂的检测方 法 技术领域 [0001]本发明涉及化学分析技 术领域， 具体涉及一种异双官能交联剂的检测方法。 背景技术 [0002]4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(CAS#92921 ‑24‑ 9)， 是一种常见 的水溶性异双官能交联剂， 钠盐包含一个胺反应性的羟基琥珀酰亚胺基团 和一个巯基反应性的马来 酰亚胺基团， 常用于结合胺和巯基， 形成稳定的酰胺键和硫醚键 。 [0003]如论文Versatile  RHDV Virus‑Like Particles:Incorporation  of Antigens   by Genetic  Modification  and Chemical  Conjugation(Biotechnology  and  Bioengineering,98(5),968 ‑977,2007)报道， 4 ‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸 基琥珀酰亚胺酯钠盐可用作 交联剂使小肽和蛋白质结合到兔出血性疾病病毒样颗粒疫苗 表面， 从而克服嵌合病毒样颗粒疫苗形成和产量的限制。 [0004]如论文Improved  performance  of collagen  scaffolds  crosslinked  by  Traut’s reagent and Sulfo‑SMCC(Journal  of Biomaterials  Science,Polymer   Edition,28(7),629 ‑647,2017)报道， 适量的4 ‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸基 琥珀酰亚胺酯钠盐交联胶原蛋白支架是一种有效且安全的方法， 该方法可用于修饰天然衍 生的胶原蛋白支 架， 在组织再生中具有显著的潜在用途。 [0005]然而， 4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐可能会引 起皮肤刺激、 腐蚀， 造成严重眼刺激、 损伤， 引起呼吸道刺激、 特异 性靶器官毒性， 因此， 有必 要对该异双官能交联剂的检测方法进行研究。 [0006]在现有技术中， 一般使用LC ‑DAD来对4 ‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸 基琥珀酰亚胺酯钠盐进行检测， 然而LC ‑DAD的检测限一般为0.5 μg/mL， 难以对更低浓度的 4‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸磺酸基琥珀酰 亚胺酯钠盐进行检测。 发明内容 [0007]本发明是为了解决上述问题而进行的， 目的在于提供一种可用于检测低浓度的异 双官能交联剂的检测方法， 尤其是一种检测低浓度4 ‑(N‑马来酰亚胺甲基)环己烷 ‑1‑羧酸 磺酸基琥珀酰 亚胺酯钠盐含量的方法。 [0008]本发明提供了一种异双官能交联剂的检测方法， 该检测方法为液相色谱 ‑质谱检 测法， 具有这样的特 征， 包括： [0009]液相色谱检测过程中的流动相为流动相A和流动相B， 流动相A为第一混合溶液， 流 动相B为第二混合溶液， 第一混合溶液为甲酸和乙腈的混合溶液， 第二混合溶液为甲酸和水 的混合溶 液； [0010]液相色谱检测过程中采用梯度洗脱的方式使流动相通过色谱柱， 洗脱梯度为： 总 洗脱时间分为N步依次进 行梯度洗脱， 前N ‑1步梯度中流动相A的比例由(0～10)％渐次升至 (85～95)％， 流动相B的比例由(90～100)％渐次降至(5～15)％， 第N步时流动相A比例为说　明　书 1/6 页 3 CN 115541750 A 3