(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211111462.1 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 甘肃农业大 学 地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村1 号 (72)发明人 方彦　刘丽君　马骊　董云　杨刚　 武军艳　蒲媛媛　王旺田　孙万仓　 (74)专利代理 机构 北京慕达星云知识产权代理 事务所 (特殊普通合伙) 11465 专利代理师 马思瑶 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) G01N 30/72(2006.01)G01N 30/86(2006.01) (54)发明名称 一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方 法及应用 (57)摘要 本发明公开了一种在冬油菜越冬期检测抗 寒标志物的方法， 包括以下步骤： 从冬油菜六叶 期开始采集根系； 冬油菜根系脂质提取； 采用液 相色谱‑质谱分析鉴定目标脂质分子结构， 通过 同位素内标对不同类别脂质进行定量分析； 组间 差异脂质筛选； 确定在抗寒品种(系)与耐寒品种 (系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒 标志物。 本发明方法是在冬油菜越冬期， 采集自 然降温状态下不同抗寒级别冬油菜品种(系)根 部组织； 采用拟靶向脂质组学获得 冬油菜根系脂 质定性定量结果， 对不同品种(系)的冬油菜根部 的共有差异脂质分子进行方差分析， 确定抗寒 有 关的标志物， 可以用于冬油菜抗寒性评价、 抗寒 品种(系)选 育等方面。 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 CN 115308340 A 2022.11.08 CN 115308340 A 1.一种在冬油菜 越冬期检测抗寒标志 物的方法， 其特 征在于,包括以下步骤： 1)从冬油菜六叶期开始采集根系， 采样间隔期20 ‑30天。 每品种(系)采集3株根系洗去 泥土， 去离子水冲洗后晾干水分， 切碎后混合获得1个 混样， 每品种(系)每次采集6个 混样，‑ 80℃保存备用； 2)冬油菜根系脂质提取， 每品种(系)6次生物学重复； 3)采用液相色谱 ‑质谱分析鉴定固醇脂类、 脂肪酰类、 甘油磷脂类、 甘油酯类和鞘脂类 目标脂质分子结构， 通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析； 4)组间差异脂质筛 选； 5)确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗寒标 志物。 2.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法， 所述冬油菜根 系脂质提取的方法包括以下步骤： 每个生物学重复取60mg混样加入300 μL甲醇和水的混合物， 甲醇和水的体积比为1:1， ‑ 20℃的条件下静置2min； 用频率为60Hz研磨机研磨2min； 加入300 μL氯仿， 涡旋30s后2 5℃超 声提取10min， 超声功率为300W； ‑20℃静置20min， 最后 在4℃的条件下离心10min， 离心转速 为13000rpm， 取20 0 μL下层氯仿层装 入LC‑MS进样瓶中； 对残渣二次提取后取3 00 μL下层氯仿层， 放入所述 LC‑MS进样瓶中挥干； 用200 μL异丙醇和甲醇的混合物， 异丙醇和甲醇的体积比1:1， 复溶LC ‑MS瓶中的脂质残 渣， 然后加入混合同位素内标20 μL， 将溶液转移至1.5mL的离心管中， 再在 ‑20℃的条件 下静 置2h， 最后在4℃的条件下离心10min， 离心转速为13000rpm， 取150 μL上清液装入带内衬管 的LC‑MS进样瓶中， 得到冬油菜根系脂质提取物。 3.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法， 其特征在于， 液 相色谱测定的条件为： 色谱柱： ACQUITY  UPLC HSS T3， 100mm ×2.1mm,1.8um， 流动相A： 乙 腈:水＝(60:40， V/V)， 含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵； 流动相B： 乙腈:异丙醇＝(10:90， V/ V)， 含0.1wt％甲酸和10mM甲酸铵； 柱温5 5℃， 流速： 0.3 5mL/min； 进样量： 5μL； 梯度洗脱条件如下： 0～5min： 55％B； 5～10min： 55％B～60％B； 10～ 13min： 60 ％B～70％B； 13～ 15min： 70 ％B～90％B； 15～ 16min： 90 ％B～100％B； 16～ 18min： 100％B。 4.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法， 其特征在于， 所 述质谱分析条件如下： 气帘气35psi； 离子喷雾电压 ‑4500/5500V； 源温度350℃； 雾化气: 40psi； 辅助加热气 :45psi， 采用sc hedule‑MRM模式对脂类物质进行高通 量分析。 5.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法， 其特征在于， 所 述组间差异脂质筛选方法为： 采用正交偏最小二乘方 ‑判别分析中， 变量权重值第一主成分 的VIP值>1和T检验的p ‑value值< 0.05作为筛选差异脂质的标准。 6.根据权利要求1所述的一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法， 其特征在于， 所 述抗寒标志物的确定方法为： 对不同品种(系)采样期共有差异脂质进行方差分析， 确定在 抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中 明显高表达的脂质为冬油菜 越冬期抗寒标志 物。 7.一种权利要求1 ‑6任一项所述的在冬油菜越冬期检测抗寒标志物的方法在冬油菜抗 寒性评价、 抗寒品种或品系选 育中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115308340 A 2一种在冬油菜越冬期检测抗 寒标志物的方 法及应用 技术领域 [0001]本发明属于冬油菜抗寒性鉴别技术领域， 涉及一种在冬油菜越冬期检测抗寒标志 物的方法及应用， 更具体的说是涉及通过拟靶向脂质组学的分析方法获得冬油菜根系脂质 定性定量结果， 对不同品种(系)的冬油菜根部的共有差异脂质分子进行方差分析， 确定抗 寒有关的标志 物。 背景技术 [0002]北方旱寒区冬季漫长， 极端低温达到 ‑32℃。 超强抗寒白菜型冬油菜是一种能在北 方旱寒区稳定越冬， 返青率高的越冬油料作物。 越冬期冬油菜地上部 分枯萎， 只有根系保持 活力。 根系抗寒性是决定冬油菜在该区 能否安全 越冬的关键因子 。 [0003]膜的流动性是维持正常膜功能的基础， 脂类是细胞膜的重要结构组分。 脂质在植 物应对寒冷胁迫中发挥重要作用。 脂类物质的变化是生物体响应外界因素变化的特征表 现。 脂质组学通过研究脂质提取物， 可获得脂质组的信息， 了解在特定生理状态下脂质的整 体变化。 [0004]目前， 油菜抗寒性鉴定主要用田间鉴定和实验室鉴定等方法。 田间主要统计越冬 率， 实验室主要测定与抗寒相关的生理指标， 很少有通过脂质分析对不同抗寒品种(系)进 行分析鉴别。 [0005]因此研发一种采用拟靶向脂质组学分析法明确与冬油菜抗寒有关的特征标志代 谢物， 在冬油菜越冬期 检测抗寒标志物的方法及应用是本领域技术人员亟需解决的技术问 题。 发明内容 [0006]有鉴于此， 本发明提供了一种在冬油菜 越冬期检测抗寒标志 物的方法及应用。 [0007]为了实现上述目的， 本发明采用如下技 术方案： [0008]一种在冬油菜 越冬期检测抗寒标志 物的方法， 包括以下步骤： [0009]1)从冬油菜六叶期开始采集根系， 采样间隔期20 ‑30天。 每品种(系)采集3株根系 洗去泥土， 去离子水冲洗后晾干水分， 切碎后混合 获得1个混样， 每品种(系)每次采集6个混 样，‑80℃保存备用； [0010]2)冬油菜根系脂质提取， 每品种(系)6次生物学重复； [0011]3)采用液相色谱 ‑质谱分析鉴定固醇脂类、 脂肪酰类、 甘油磷脂类、 甘油酯类和鞘 脂类目标脂质分子结构， 通过同位素内标对不同类别脂质进行定量分析； [0012]4)组间差异脂质筛 选； [0013]5)确定在抗寒品种(系)与耐寒品种(系)中明显高表达的脂质为冬油菜越冬期抗 寒标志物。 [0014]进一步， 上述冬油菜根系脂质提取的方法包括以下步骤： [0015]每个生物学重复取60mg混样加入300μL 甲醇和水的混合物， 甲醇和水的体积比为说　明　书 1/7 页 3 CN 115308340 A 3