(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211193361.3 (22)申请日 2022.09.28 (71)申请人 新希望乳业股份有限公司 地址 610063 四川省成 都市锦江区金石路 366号新希望中鼎国际2栋18楼3号 (72)发明人 宋艳梅　周欢　范光彩　夏忠悦　 黄漫蓉　骆敏　马静　谭莲英　 (74)专利代理 机构 四川力久律师事务所 512 21 专利代理师 陈明龙 (51)Int.Cl. G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (54)发明名称 一种同时检测牛奶中α、 β、 κ-酪蛋白及 β-乳球蛋白含量的方法 (57)摘要 本发明公开了一种同时检测牛奶中α、 β、 κ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 本申请选 用试剂A和试剂B以及β ‑巯基乙醇对检测标准样 品和牛奶检测样品进行制备， 并通过控制试剂A 和试剂B的添加量， 仅采用高效液相色谱仪， 再通 过流动相A和流动相B种类及浓度的选择， 洗脱 程 序的控制， 即可快速精确的一次性检测出牛奶中 α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量， 且该方法 操作简单， 检测效率高， 耗时短， 便 于推广应用。 权利要求书2页 说明书18页 附图5页 CN 115494178 A 2022.12.20 CN 115494178 A 1.一种同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其特征在于， 包括以 下步骤： 步骤1、 分别制备α ‑酪蛋白标准品、 β ‑酪蛋白标准品、 κ ‑酪蛋白标准品以及β ‑乳球蛋白 标准品； 步骤2、 制备 牛奶检测样品： 步骤2.1、 将牛奶置 于第一离心管内， 进行第一离心处 理； 步骤2.2、 然后， 移取第一离心管内中间层的奶样200~400μL， 置于第二离心管中， 加入 400 μL以上的试剂A； 混合均匀， 第二离心处 理； 步骤2.3、 然后， 移取第二离心管内中间层的奶样400 μL～600 μL， 置于第三离心管中， 依 次加入450 μL以上的试剂B和8 μL以上的β ‑巯基乙醇， 混合均匀， 滤膜过滤， 得到牛奶检测样 品； 步骤3、 对所述步骤2得到的牛奶样品进行高效液相色谱检测， 得到色谱图， 根据色谱图 中的出峰分别计算出 牛奶中α 、 β 、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白的含量； 其中， 所述试剂A主要由以下方法制备得到的： 将28g～30g盐酸胍、 1g～2gBis ‑TRIS以 及0.05g～0.1g的三水柠檬酸钠混合， 用水 溶解、 稀释定容至 50mL； 所述试剂B主要由以下方法制备得到的： 将20g～22g的盐酸胍加水溶解、 稀释定容至 50mL。 2.根据权利要求1所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述α ‑酪蛋白标准品主要由以下方法制备而成的： 称取α ‑酪蛋白纯品， 加入 试剂 A， 混合均匀， 之后依次加入试剂B和β ‑巯基乙醇， 混合均匀， 滤膜过滤， 得到α ‑酪蛋白标准 品； 其中， α ‑酪蛋白纯品： 所述试剂A、 试剂B与β ‑巯基乙醇合计量的质量体积比为1mg～ 20mg： 1mL； 其中， 所述试剂A、 所述试剂B以及β ‑巯基乙醇的体积比例为450～550:440～540: 10。 3.根据权利要求2所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述β ‑酪蛋白标准品主要由以下方法制备而成的： 称取β ‑酪蛋白纯品， 加入 试剂 A， 混合均匀， 之后依次加入试剂B和β ‑巯基乙醇， 混合均匀， 滤膜过滤， 得到β ‑酪蛋白标准 品； 其中， β ‑酪蛋白纯品： 所述试剂A、 试剂B与β ‑巯基乙醇合计量的质量体积比为1mg～ 20mg： 1mL； 其中， 所述试剂A、 所述试剂B以及β ‑巯基乙醇的体积比例为450～550:440～540: 10。 4.根据权利要求3所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述κ ‑酪蛋白标准品主要由以下方法制备而成的： 称取κ ‑酪蛋白纯品， 加入 试剂 A， 混合均匀， 之后依次加入试剂B和β ‑巯基乙醇， 混合均匀， 滤膜过滤， 得到κ ‑酪蛋白标准 品； 其中， κ ‑酪蛋白纯品： 所述试剂A、 试剂B与β ‑巯基乙醇合计量的质量体积比为1mg～ 20mg： 1mL； 其中， 所述试剂A、 所述试剂B以及β ‑巯基乙醇的体积比例为450～550:440～540: 10。 5.根据权利要求4所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述β ‑乳球蛋白标准品主要由以下方法制备而成的： 称取β ‑乳球蛋白纯品， 加入 试剂A， 混合均匀， 之后依次加入 试剂B和β ‑巯基乙醇， 混合均匀， 滤膜过滤， 得到β ‑乳球蛋白 标准品； 其中， β ‑乳球蛋白纯品： 所述试剂A、 试剂B与β ‑巯基乙醇合计量的质量体积比为1mg权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115494178 A 2～20mg： 1mL； 其中， 所述试剂A、 所述试剂B以及β ‑巯基乙醇的体积比例为450～550:440～ 540:10。 6.根据权利要求5所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述第一离心处理过程中， 转速为8000r/min～15000r/min， 离心处理的时间为 3min～10min； 所述第二离心处理过程中， 转速为8000r/min～15000r/min， 离心处理的时间 为3min～10min。 7.根据权利要求6所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述步骤2.2中， 然后， 移取第一离心管内中间层的奶样250~400 μL， 置于第二离 心管中， 加 入400 μL~800 μL试剂A； 混合均匀， 第二离心处理； 所述步骤2.3中， 移取第二离心 管内中间层的奶样450 μL～600 μL， 置于第三离心管中， 依次加入450 μL~600 μL试剂B和8 μL～ 12 μLβ‑巯基乙醇。 8.根据权利要求7所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述试剂A主要由以下方法制备得到的： 将28.5g～30g盐酸胍、 1.2g～2gBis ‑ TRIS以及0.06g～0.1 g的三水柠檬酸钠混合， 用水溶解、 稀释 定容至50mL； 所述试剂B主要由 以下方法制备 得到的： 将20.5g～ 22g的盐酸胍加水 溶解、 稀释定容至 50mL。 9.根据权利 要求1‑8任意一项所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量 的方法， 其特征在于， 所述步骤3中， 高效液相色谱检测过程中， 流动相A： 体积浓度为0.1%～ 0.2%三氟乙酸乙腈溶 液， 流动相B： 体积浓度为0.1% ～0.2%三氟乙酸水 溶液。 10.根据权利 要求9所述的同时检测牛奶中α、 β、 κ ‑酪蛋白及β ‑乳球蛋白含量的方法， 其 特征在于， 所述 步骤3中， 高效液相色谱检测过程中， 洗脱程序为： 0min， 25%%流动相A，  75%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 2～3min， 30%流动相A， 70%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 15～18mi n， 35%流动相A， 6 5%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 30～33min， 40%流动相A，  60%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 42～45min， 45%流动相A， 5 5%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 45～48mi n， 55%流动相A， 45% %流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 50～53min， 55%流动相A， 45%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 53～55min， 25%流动相A，  75%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min； 62～65min， 24%流动相A， 76%流动相B， 流速为0.5  mL/min～0.8 mL/min。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115494178 A 3